Sicherheit und Immunogenität eines thermostabilen ID93 + GLA

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1138 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Adjuvanshaltige Subunit-Impfstoffe stellen einen vielversprechenden Ansatz zum Schutz vor Tuberkulose (TB) dar, aktuelle Kandidaten erfordern jedoch eine gekühlte Lagerung. Hier präsentieren wir Ergebnisse einer randomisierten, doppelblinden klinischen Phase-1-Studie (NCT03722472), in der die Sicherheit, Verträglichkeit und Immunogenität einer thermostabilen lyophilisierten Einzelampulle des Impfstoffkandidaten ID93 + GLA-SE im Vergleich zu den beiden nicht thermostabilen Impfstoffen bewertet wurde - Präsentation des Impfstoffs durch Durchstechflaschen bei gesunden Erwachsenen. Die Teilnehmer wurden nach intramuskulärer Verabreichung von zwei Impfstoffdosen im Abstand von 56 Tagen auf primäre, sekundäre und explorative Endpunkte überwacht. Zu den primären Endpunkten gehörten lokale und systemische Reaktogenität sowie unerwünschte Ereignisse. Zu den sekundären Endpunkten gehörten Antigen-spezifische Antikörper (IgG) und zelluläre Immunantworten (zytokinproduzierende mononukleäre Zellen des peripheren Blutes und T-Zellen). Beide Impfstoffdarreichungen sind sicher und gut verträglich und lösen robuste Antigen-spezifische Serumantikörper und zelluläre Immunantworten vom Th1-Typ aus. Im Vergleich zur nicht-thermostabilen Darreichungsform erzeugt die thermostabile Impfstoffformulierung stärkere Serum-Antikörperreaktionen (p < 0,05) und mehr Antikörper-sezernierende Zellen (p < 0,05). In dieser Arbeit zeigen wir, dass der thermostabile Impfstoffkandidat ID93 + GLA-SE bei gesunden Erwachsenen sicher und immunogen ist.

Tuberkulose (TB) ist eine der häufigsten infektiösen Ursachen für Morbidität und Mortalität. Im Jahr 2020 starben weltweit 1,5 Millionen Menschen und verursachten 10 Millionen Neuinfektionen. Zwei Drittel der neuen Fälle treten in acht Ländern auf (Indien, China, Indonesien, Philippinen, Pakistan, Nigeria, Bangladesch und Südafrika)1. Seit über 100 Jahren wurde nur ein Impfstoff zur Vorbeugung von Tuberkulose weit verbreitet (Bacillus Calmette-Guérin oder BCG). Dieser Impfstoff hat eine begrenzte Wirksamkeit bei der Vorbeugung von Tuberkuloseerkrankungen und ist vor allem für die Vorbeugung von Tuberkulose-Meningitis und Miliary-Erkrankungen bei kleinen Kindern geeignet2. Die Wirksamkeit des Impfstoffs bei Erwachsenen oder zur Vorbeugung von Lungenerkrankungen ist eher bescheiden3 und die Verfügbarkeit von BCG ist gelegentlich begrenzt4.

Bemühungen zur Entwicklung neuer Tuberkulose-Impfstoffe stützten sich meist auf die rationale Auswahl von Antigenen, die durch die Kombination mit Impfstoff-Adjuvantien immunogener wurden5. Der Bereich der Entwicklung von adjuvantierten Subunit-TB-Impfstoffen hat durch die ~50-prozentige Wirksamkeit, die mit dem M72/AS01E-Kandidaten in klinischen Phase-2b-Tests erreicht wurde, neuen Schwung erhalten6. Weitere adjuvanshaltige Subunit-TB-Impfstoffkandidaten befinden sich ebenfalls in der klinischen Entwicklung7. Beispielsweise zeigte ID93 + GLA-SE in klinischen Phase-2a-Tests vielversprechende Sicherheit und Immunogenität8. Trotz dieser Fortschritte befinden sich derzeit keine thermostabilen, adjuvantierten Tuberkulose-Impfstoffkandidaten in der klinischen Entwicklung. Angesichts der enormen weltweiten Belastung durch Tuberkulose, insbesondere in Südostasien und Afrika südlich der Sahara, könnte ein thermostabiler Impfstoff erhebliche Vorteile für die weltweite Impfstoffverteilung bieten9.

Zur Erhöhung der Thermostabilität von Impfstoffen können verschiedene Technologien eingesetzt werden10,11. Allerdings erhöht die Anpassung thermostabiler Technologien für Impfstoffe, die Adjuvantien enthalten, die Komplexität erheblich11. Beispielsweise werden häufig Trocknungstechnologien wie Lyophilisierung oder Sprühtrocknung eingesetzt, um die Stabilität von Impfstoffen zu verbessern. Die Aufrechterhaltung der Partikelstruktur, die der Aktivität vieler Impfstoff-Adjuvans-Formulierungen, einschließlich Emulsionen und Aluminiumsalzen, innewohnt, erfordert jedoch einzigartige Ansätze zur Prozessentwicklung und Charakterisierung. Wir haben zuvor das Formulierungsdesign, die Prozessentwicklung und die Herstellung einer lyophilisierten Formulierung des emulsionsadjuvantierten Untereinheiten-TB-Impfstoffkandidaten ID93 + GLA-SE beschrieben, die bei Lagerung bei 37 °C drei Monate lang stabil blieb12,13.

Hier präsentieren wir Ergebnisse einer randomisierten, doppelblinden klinischen Phase-1-Studie zur Bewertung der Sicherheit, Verträglichkeit und Immunogenität dieses lyophilisierten ID93 + GLA-SE-Impfstoffkandidaten in einer einzigen Durchstechflasche im Vergleich zu der zuvor entwickelten Darreichungsform mit zwei Durchstechflaschen gesunde erwachsene Probanden. Wir zeigen, dass die thermostabile Einzelampullenpräsentation von ID93 + GLA-SE ein ähnliches Sicherheitsprofil und ein vergleichbares oder verbessertes Immunogenitätsprofil wie die nicht thermostabile Zweiampullenpräsentation des Impfstoffs hervorruft.

Die Teilnahme menschlicher Probanden an der Studie erfolgte von der Rekrutierung am 29. Oktober 2018 bis zur Nachuntersuchung und endete am 15. Juni 2020. Insgesamt 93 Teilnehmer wurden über einen Rekrutierungszeitraum von 6 Monaten auf Studieneinschluss überprüft, von denen sich 48 trafen entsprachen den Studieneintrittskriterien und wurden 1:1 in zwei Behandlungsgruppen randomisiert (Abb. 1). Unter den 45 Screening-Fehlern waren die häufigsten Ausschlussgründe Screening-Laborwerte, die nicht im Normbereich lagen, andere medizinische Bedingungen, mangelnder allgemeiner Gesundheitszustand und Nichteinhaltung des Protokolls (Abb. 1). Alle 48 eingeschriebenen Teilnehmer erhielten mindestens eine Injektion (Sicherheitspopulation), 45 Teilnehmer erhielten beide Injektionen und 44 Teilnehmer schlossen die Studie planmäßig ab (Pro-Protokoll-Population). Von den drei Teilnehmern, die in der Behandlungsgruppe 2 (nicht thermostabiler Tuberkulose-Impfstoff) nur die erste Studienimpfung erhielten, konnten zwei nicht nachuntersucht werden, und einer wurde aufgrund einer Arbeitsplatzpflicht zur Impfung mit einem anderen Impfstoff nicht zugelassen. Proben von Teilnehmern, die nur eine Studieninjektion erhielten, wurden vor dem 56. Studientag in die Analyse der Immunogenitätsdaten einbezogen. Danach wurden nur Proben von Teilnehmern, die beide Studieninjektionen erhielten, in die Immunogenitätsanalyse einbezogen. Ein weiterer Studienteilnehmer schied nach dem 70. Studientag freiwillig aus der Studie aus. Insgesamt 45 Teilnehmer beendeten den Langzeit-Nachuntersuchungsbesuch am 421. Studientag (44 erhielten beide Injektionen und 1 erhielt eine Injektion). Weitere Abweichungen vom Protokoll, wie z. B. versäumte Besuche und/oder Verfahren, werden in den Zusatzinformationen beschrieben. Tabelle 1 fasst die demografischen und anderen Basismerkmale der in der Sicherheitspopulation enthaltenen Teilnehmer zusammen (n = 48). Sechsunddreißig der 48 Teilnehmer (75 %) waren weiblich und 12 (25 %) waren männlich. Das Alter der Teilnehmer bei der Einschreibung lag zwischen 18 und 48 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 23 Jahren. Der durchschnittliche Body-Mass-Index (BMI) der Teilnehmer betrug 24,1. Zu den Rassen zählten 43 (90 %) Weiße, 2 (4 %) Asiaten, 2 (4 %) Mischlinge und 1 (2 %) Schwarze oder Afroamerikaner.

Von den 93 untersuchten Probanden erfüllten 48 die Studienkriterien und wurden aufgenommen und zufällig zwei Behandlungsgruppen zugeordnet. Behandlungsgruppe 1 umfasste 23 Teilnehmer, die den thermostabilen Einzelfläschchen-Impfstoff ID93 + GLA-SE erhielten; Die Behandlungsgruppe 2 umfasste 25 Teilnehmer, die den nicht thermostabilen Zweifläschchen-Impfstoff ID93 + GLA-SE erhielten. Die Sicherheitspopulation umfasst Teilnehmer, die mindestens eine Injektion erhalten. Die Pro-Protokoll-Population stellt Teilnehmer dar, die die Studie planmäßig abgeschlossen haben.

Beide Darreichungsformen des ID93 + GLA-SE-Impfstoffs erwiesen sich nach intramuskulärer (IM) Verabreichung als sicher und gut verträglich bei gesunden erwachsenen Teilnehmern. Muster, Art, Schwere und Häufigkeit unerwünschter Ereignisse (UE) waren in beiden Behandlungsgruppen ähnlich. Tabelle 2 fasst den Anteil der Teilnehmer mit UE nach Schweregrad, Zusammenhang mit der Studieninjektion und Behandlungsgruppe zusammen. UE wurden bei 98 % aller Studienteilnehmer gemeldet. Die höchsten gemeldeten UE-Werte waren Grad 1 bei 96 % und 92 % bzw. Grad 2 bei 22 bzw. 36 % der Teilnehmer in den Behandlungsgruppen 1 und 2. Es wurden keine UE 3. oder 4. Grades, schwerwiegende unerwünschte Ereignisse (SAE) oder potenzielle immunvermittelte Erkrankungen (PIMMCs) gemeldet. Lokale und systemische Reaktogenität war häufig. Die meisten Teilnehmer berichteten über Schmerzen und/oder Druckempfindlichkeit an der Injektionsstelle, wobei Müdigkeit, Kopfschmerzen und Myalgie die häufigsten systemischen Auswirkungen waren. Infektionen der oberen Atemwege oder ein Abfall des Hämoglobins bei einigen Teilnehmern wurden nicht als behandlungsbedingt angesehen (Ergänzende Informationen, Studienprotokoll). Die meisten UE verschwanden ohne Behandlung und kein Teilnehmer brach die Studie aufgrund eines UE ab. Daher wurde festgestellt, dass die thermostabile Einzelampullen-Darreichung des ID93 + GLA-SE-Impfstoffkandidaten bei der bei gesunden Erwachsenen verabreichten Dosis ähnlich sicher und gut verträglich ist wie die nicht thermostabile Zweiampullen-Darstellung des Impfstoffs.

Die IgG-Antikörperreaktionen auf ID93 wurden in jeder Behandlungsgruppe bewertet. An Proben, die an den Studientagen 0, 14, 56, 70, 84 und 224 entnommen wurden, wurden Serum-IgG-Antikörper-ELISAs für Gesamt-IgG, IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 durchgeführt. Das Gesamt-IgG wurde auch für die Proteinuntereinheiten von ID93 (Rv1813, Rv2608, Rv3619 und Rv3620) bewertet. Die Serumspiegel von ID93-spezifischen IgG-Antikörpern werden als mittlerer Endpunkttiter (MEPT) zusammen mit der Ansprechrate und der fachen Änderung für Gesamt-IgG nach Behandlungsschema dargestellt (Abb. 2a–g und Ergänzungstabelle 1). Teilnehmer beider ID93- und GLA-SE-Behandlungsgruppen entwickelten robuste ID93-spezifische Antikörperreaktionen mit einem zu Studienbeginn festgestellten niedrigen Hintergrundniveau. Die ID93-spezifischen IgG-Antworten blieben in beiden Therapien bis zu 6 Monate nach der letzten Impfung erhöht. Die ID93-spezifischen IgG1- und IgG3-Antworten waren höher als die IgG2- und IgG4-Antworten. Die für die ID93-Untereinheit spezifischen Gesamt-IgG-Antworten waren für Rv1813 am höchsten, gefolgt von Rv2608, Rv3620 und Rv3619 (ergänzende Abbildung 1). In allen Fällen wurden die höchsten Antikörperreaktionen nach der zweiten Injektion beobachtet. Die Ansprechraten für ID93-spezifisches Gesamt-IgG, basierend auf einem vierfachen Anstieg gegenüber dem Ausgangswert, betrugen an den Studientagen 70 und 84 für beide Behandlungsgruppen 90–100 % (Abb. 2a). Am Studientag 224 lagen die IgG-Antwortraten zwischen 63 und 85 % (Abb. 2a). Ein Vergleich der thermostabilen Einzelampullenpräsentation mit der nicht thermostabilen Zweiampullenpräsentation zeigte, dass das thermostabile Format bei mehreren Auslesungen zu den Spitzenzeitpunkten eine deutlich höhere Antikörperreaktion hervorrief. Im Vergleich zur nicht thermostabilen Zwei-Fläschchen-Formulierung verstärkte die thermostabile Einzel-Fläschchen-Formulierung beispielsweise die fache Veränderung des ID93-spezifischen IgG (190,5 vs. 33,0 am Studientag 70 [p = 0,0023] und 97,4 vs. 32,2 am Studientag). 84 [p = 0,0495]) (Abb. 2b) und der ID93-spezifische IgG MEPT (10868 vs. 2583 am Studientag 70 [p = 0,0061]) (Abb. 2c).

n = 20–25 biologisch unabhängige Proben, je nach Behandlungsgruppe und Zeitpunkt, siehe Ergänzungstabelle 1. Die Serumantikörper-Reaktionsrate wurde als mindestens vierfacher Anstieg des ID93-spezifischen IgG gegenüber dem Ausgangswert berechnet, gemessen durch ELISA. Die Rücklaufquoten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests verglichen. Unterschiede wurden auf der Grundlage eines zweiseitigen Tests und p ≤ 0,05 (α = 0,05) mit Bonferroni-Anpassung zur Berücksichtigung der mehreren Zeitpunkte festgestellt. b–i Die Daten zwischen den beiden Behandlungsgruppen wurden mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests mit Bonferroni-Anpassung verglichen, um die mehreren Zeitpunkte zu berücksichtigen. b Fachliche Veränderungen des ID93-spezifischen Gesamt-IgG im Serum gegenüber dem Ausgangswert, gemessen durch ELISA. **p = 0,0023 (Studientag 70), *p = 0,0495 (Studientag 84). c Längsschnittdiagramm der Gruppe MEPT für ID93-spezifisches Gesamt-IgG im Serum, gemessen durch ELISA. **p = 0,0061. d–g Längsschnittdiagramme der MEPT ID93-spezifischen IgG-Unterklassen der Gruppe im Serum, gemessen durch ELISA. d IgG1. **p = 0,0032 (Studientag 70), **p = 0,0040 (Studientag 84). e IgG2. f IgG3. g IgG4. h Zählung von ID93-spezifischen IgG-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben, gemessen mit dem ELISpot-Assay. **p = 0,0085. i Zählung von ID93-spezifischen IgG-Gedächtnis-B-Zellen in PBMC-Proben, gemessen mit dem ELISpot-Assay. Mittelwerte werden durch Symbole dargestellt und Fehlerbalken zeigen das 95 %-KI des Mittelwerts an. Sternchen zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied (*p < 0,05, **p < 0,01) zwischen den Behandlungsgruppen zu diesem Zeitpunkt nach Korrektur für mehrere Vergleiche an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

ID93-spezifische IgG-Antikörper-sekretierende Zellen in PBMC-Proben wurden an den Studientagen 0, 7, 56 und 63 mittels Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) bewertet. Obwohl die Reaktionen in beiden Behandlungsgruppen zu den meisten Zeitpunkten in der Nähe des Ausgangsniveaus blieben, ist dies bemerkenswert Am Studientag 63 wurde ein Anstieg der Anzahl ID93-spezifischer IgG-Antikörper-sezernierender Zellen in der Gruppe mit thermostabilen Impfstoffen mit einer Ampulle gemessen, während die Reaktion in der Gruppe mit nicht thermostabilen Impfstoffen mit zwei Ampullen niedrig blieb (Abb. 2h). ID93-spezifische IgG-Gedächtnis-B-Zellen in Proben peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) wurden ebenfalls an den Studientagen 0, 56, 84 und 224 von ELISpot gemessen. Die IgG-Gedächtnis-B-Zellen schienen in beiden Behandlungsgruppen 4 Wochen nach der zweiten zuzunehmen Injektion, aber die Reaktionen waren am Studientag 224 wieder auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt (Abb. 2i). In Übereinstimmung mit dem zuvor beschriebenen Muster der IgG-Reaktionen im Serum führte die thermostabile Einzelampullenpräsentation nach der zweiten Immunisierung zu einem signifikanten Anstieg der ID93-spezifischen IgG-sekretierenden Plasmazellen im Vergleich zur nicht thermostabilen Zweiampullenpräsentation.

Die ID93-spezifischen IgA-Reaktionen der Schleimhaut wurden durch ELISA unter Verwendung von Nasenabstrichen und Tränenproben an den Studientagen 0, 70 und 224 bewertet. Die ID93-spezifische IgA-Reaktion in den Schleimhautproben blieb jedoch zu allen Zeitpunkten in beiden Behandlungsgruppen auf dem Ausgangsniveau ( Ergänzende Abb. 2a, b). Ebenso stiegen ID93-spezifische IgA-Antikörper-sekretierende Zellen und IgA-Gedächtnis-B-Zellen in PBMC-Proben nicht signifikant über die Ausgangswerte an (ergänzende Abbildung 2c, d). Somit schien keine der Behandlungsgruppen antigenspezifische IgA-Antikörperreaktionen in den Schleimhautproben oder in PBMCs hervorzurufen.

Um die Anzahl der IFN-γ- und IL-10-Zytokin-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben als Reaktion auf ID93 zu quantifizieren, wurden ELISpot-Assays an Proben durchgeführt, die an den Studientagen 0, 14, 56, 70, 84 und 224 gesammelt wurden. IFN-γ Die auf der MIMOSA-Analyse basierenden Ansprechraten erreichten nach der zweiten Injektion ihren Höhepunkt bei 70–76 % am Studientag 70 für beide Behandlungsgruppen (Abb. 3a). Am Studientag 224 lagen die IFN-γ-Antwortraten zwischen 53 und 65 % (Abb. 3a). Teilnehmer beider ID93 + GLA-SE-Behandlungsgruppen entwickelten robuste ID93-spezifische IFN-γ-PBMC-Rückrufreaktionen, gemessen anhand der Gesamt-SFU pro Million PBMCs, die IFN-γ produzieren (Ergänzungstabelle 2 und Abb. 3b). Diese Reaktionen hielten bei beiden Therapien bis zu 6 Monate nach der letzten Impfung an. Andererseits wurde in IL-10-produzierenden Zellen eine geringe Reaktivität gegenüber ID93 beobachtet (Ergänzungstabelle 3 und Abb. 3c, d). Dieses Muster einer erhöhten Anzahl von IFN-γ-ausscheidenden Zellen und einer geringen Menge an IL-10-ausscheidenden Zellen weist auf eine Immunantwort vom Th1-Typ hin. Ein Vergleich der beiden Impfstoffpräsentationen zeigte keine signifikanten Unterschiede, obwohl das thermostabile Einzelampullen-Impfstoffformat tendenziell stärkere Reaktionen hervorrief. Die IFN-γ- und IL-10-Spiegel von PBMCs, die durch Peptidpools der ID93-Untereinheit stimuliert wurden, folgten ähnlichen Mustern wie oben für ID93-stimulierte PBMCs beschrieben, jedoch in geringeren Größenordnungen (ergänzende Abbildung 3).

n = 16–25 biologisch unabhängige Proben je nach Behandlungsgruppe und Zeitpunkt, siehe Ergänzungstabellen 2–4. eine IFN-γ-Reaktionsrate durch ELISpot-Assay unter Verwendung von ID93-stimulierten PBMCs und berechnet durch MIMOSA als Änderung gegenüber dem Ausgangswert unter Verwendung von SFUs mit Hintergrundsubtraktion. b Zählung von ID93-stimulierten IFN-γ-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben, gemessen mit dem ELISpot-Assay. c IL-10-Reaktionsrate durch ELISpot-Assay unter Verwendung von ID93-stimulierten PBMCs und berechnet durch MIMOSA als Änderung gegenüber dem Ausgangswert unter Verwendung von SFUs, bei denen der Hintergrund abgezogen wurde. d Zählung von ID93-stimulierten IL-10-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben, gemessen mit dem ELISpot-Assay. e Ansprechrate nach ICS von CD4+-T-Zellen, die zwei beliebige Zytokine unter CD154, TNF, IFN-γ, IL-2, IL-21 und IL-4 exprimieren, berechnet von MIMOSA als Veränderung gegenüber dem Ausgangswert unter Verwendung von vom Hintergrund abgezogenen Häufigkeiten und Gesamtzahlen . f Häufigkeiten von ID93-stimulierten CD4+ T-Zellen, die zwei beliebige Zytokine in PBMC-Proben exprimieren, gemessen durch ICS. g Einzelner Zytokin- und polyfunktioneller Zytokin-CD4+-T-Zell-Phänotyp an den Studientagen 70 und 84, gemessen durch ICS. Anteile der ID93-stimulierten CD4+ T-Zellen, die verschiedene einzelne Zytokine und Zytokinkombinationen an den Studientagen 70 und 84 exprimieren, dargestellt durch mittlere Häufigkeiten. Die Fläche des Kreisdiagramms ist proportional zu den gesamten Medianfrequenzen für jede Anzeige. a, c, e Antwortratendiagramme zeigen Mittelwerte, die durch Symbole dargestellt werden, und Fehlerbalken zeigen das 95 %-KI des Mittelwerts. Die Rücklaufquoten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests verglichen. Unterschiede wurden auf der Grundlage eines zweiseitigen Tests und p ≤ 0,05 (α = 0,05) mit Bonferroni-Anpassungen zur Berücksichtigung der mehreren Zeitpunkte festgestellt. b, d, f Punktdiagramme stellen alle vom Hintergrund subtrahierten Werte als Symbole dar, wobei durchgezogene Linien Medianwerte und Fehlerbalken den Interquartilbereich darstellen. Die Daten zwischen den beiden Behandlungsgruppen wurden mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests mit Bonferroni-Anpassung verglichen, um die mehreren Zeitpunkte zu berücksichtigen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Prozentsatz der CD4+- und CD8+-T-Zellen, die als Reaktion auf ID93 zwei oder mehr Zytokine produzierten, wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) mit Durchflusszytometrie unter Verwendung von PBMC-Proben gemessen, die an den Studientagen 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84, und 224. Die Reaktionsrate und Häufigkeit antigenspezifischer CD4+ T-Zellen, die zwei oder mehr Zytokine exprimieren (d. h. Zellen, die zwei oder mehr Immunmarker unter IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-21 exprimieren). und CD154) wurden unter Verwendung von vom Hintergrund subtrahierten Werten berechnet. Bei beiden Impfstoffpräsentationen wurden ID93-spezifische CD4+-T-Zell-Reaktionen beobachtet (Ergänzungstabelle 4 und Abb. 3e, f). Die höchsten Ansprechraten (analysiert durch MIMOSA) traten in beiden Behandlungsgruppen am 70. Studientag auf (38–59 %) (Abb. 3e). Die Ansprechraten blieben am Studientag 224, 6 Monate nach der letzten Studieninjektion, bei 26–31 % (Abb. 3e). Die Analyse einzelner und kombinierter Zytokinprofile von ID93-spezifischen T-Zellen ergab, dass die höchsten Expressionshäufigkeiten IFN-γ, TNF und/oder IL-2 bei geringer IL-4-Reaktion zuzuschreiben waren (Abb. 3g). Während die thermostabile Impfstoffformulierung tendenziell eine höhere mittlere Häufigkeit der TNF-Reaktion hervorrief, induzierten beide Impfstoffpräsentationen eine polyfunktionale und Th1-verzerrte Immunantwort. Bei beiden Behandlungen wurden jedoch nur minimale Auswirkungen auf die ID93-spezifischen Antworthäufigkeiten von CD8+-T-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 4d und ergänzende Tabelle 5). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Unterschiede in den einzelnen Messwerten zwar statistisch nicht signifikant waren, die thermostabile Impfstoffpräsentation jedoch insgesamt einen Trend zu höheren CD4+-T-Zell-Zytokin-Antworthäufigkeiten im Vergleich zur nicht thermostabilen Impfstoffpräsentation aufwies.

Die Häufigkeit anderer T-Zell-Subtypen, einschließlich follikulärer Tfh-Helferzellen (Tfh), T-Effektor-Gedächtniszellen und zentraler T-Gedächtniszellen, sowie anderer Immunzellen, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK) und NK-T-Zellen, wurde gemessen ICS mit Durchflusszytometrie in PBMC-Proben. Beide Behandlungen erhöhten die Häufigkeit zentraler CD4+-T-Gedächtniszellen, jedoch nicht die Häufigkeit von Effektor-Gedächtniszellen im Vergleich zum Ausgangswert (ergänzende Abbildung 4a, b). Die thermostabile Einzelampullenpräsentation führte auch zu einem leichten Anstieg der Tfh-Zellfrequenzen am 63. Studientag im Vergleich zum Ausgangswert (ergänzende Abbildung 4c). Bei beiden Behandlungen wurden jedoch nur minimale Auswirkungen auf die ID93-spezifischen Antwortfrequenzen von NK-Zellen oder NK-T-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 4e, f).

Schließlich wurde die Nettohemmung des intrazellulären Mykobakterienwachstums bei jeder Behandlung anhand von Vollblutproben gemessen, die an den Studientagen 0, 70 und 224 entnommen wurden. Allerdings verbesserte keine der Impfstoffpräsentationen die Mykobakterienwachstumshemmung, wie durch die Zeit bis zur Positivität angezeigt (ergänzende Abbildung 5).

Nach unserem Kenntnisstand handelt es sich bei dieser Studie um den ersten Impfstoffkandidaten gegen thermostabile Untereinheiten gegen Tuberkulose, der in klinischen Tests evaluiert wurde11,14. Für andere Krankheitsindikationen befinden sich drei lyophilisierte, adjuvantierte Subunit-Impfstoffkandidaten in der klinischen Prüfung, klinische Ergebnisse wurden jedoch nur für einen Kandidaten veröffentlicht, ohne dass dessen potenzielle Thermostabilitätseigenschaften bewertet wurden15,16,17,18. Somit stellt der vorliegende Bericht einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der thermostabilen lyophilisierten Adjuvans-haltigen Impfstoffkandidaten dar. Bemerkenswert ist, dass einige flüssige Impfstoffformulierungen mit thermostabilen Eigenschaften klinische Tests durchlaufen und sogar eine Zulassung erhalten haben, mit erheblichen positiven Auswirkungen aufgrund ihres im Feldeinsatz nachgewiesenen Thermostabilitätsprofils11,19,20. Dennoch ist die Stabilität solcher Impfstoffe außerhalb von Kühltemperaturen im Allgemeinen auf Tage oder einige Wochen begrenzt, wohingegen die thermostabile Einzelampullenpräsentation von ID93 + GLA-SE bei 37 °C drei Monate lang stabil ist12,13.

Die spezifischen Ziele der aktuellen Phase-1-Studie bestanden darin, die Sicherheit und Immunogenität einer thermostabilen Einzelampullenpräsentation des ID93 + GLA-SE-Impfstoffkandidaten im Vergleich zur zuvor entwickelten nicht thermostabilen Zweiampullenpräsentation zu bewerten. Die hier gezeigten Sicherheitsprofile für beide Impfstoffdarreichungen stimmten mit der allgemein milden Reaktogenität überein, die in früheren klinischen Studien mit der Zweifläschchen-Impfstoffdarreichung festgestellt wurde8,21,22. Schmerzen an der Injektionsstelle waren das häufigste UE, und bei keiner der Impfstoffpräsentationen wurden UE oder SAEs vom Grad 3 oder 4 identifiziert. Somit behielt die thermostabile Impfstoffpräsentation das hervorragende Sicherheitsprofil des nicht thermostabilen ID93 + GLA-SE-Impfstoffkandidaten bei.

Eine T-Zell-Antwort vom Typ Th1 gilt als günstig für den Schutz gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)23. Es wurde zuvor gezeigt, dass die nicht thermostabile ID93 + GLA-SE-Präsentation in zwei Fläschchen robuste antigenspezifische IgG- und Th1-Typ-CD4+-T-Zellreaktionen induziert8,21,22. Die hier berichteten Immunogenitätsergebnisse für beide Impfstoffpräsentationen stimmten mit diesem Profil überein, einschließlich polyfunktioneller CD4+ T-Zellen, die IFN-γ, TNF und IL-2 exprimieren. Allerdings waren die in der aktuellen Studie verwendeten Mehrfachmessungen nicht in früheren klinischen Bewertungen von ID93 + GLA-SE enthalten, einschließlich der ELISAs für Schleimhautsekretionsantikörper, des M. tuberculosis-Wachstumshemmungstests für Vollblut und der ELISpot-Zählung von T-Zellen B-Zellen. Während bei beiden Impfstoffpräsentationen nur minimale Auswirkungen auf die mukosalen Antikörperreaktionen oder die Wachstumshemmung von M. tuberculosis im Vollblut erkennbar waren, deutete die ELISpot-basierte Zählung von Zytokin-produzierenden Zellen in ID93-stimulierten PBMC-Proben darauf hin, dass beide Präsentationen ID93 + GLA-SE enthielten löste eine robuste IFN-γ-Reaktion und eine niedrige IL-10-Reaktion aus, was mit der Th1-Typ-Antwortqualität übereinstimmt, die in den ICS-Daten aus den aktuellen und früheren Studien erkennbar ist. Interessanterweise wurde in der thermostabilen Einzelampullen-Behandlungsgruppe im Vergleich zur nicht thermostabilen Behandlungsgruppe ein allgemeiner Trend zu T-Zell-Reaktionen mit höherem Spitzenwert beobachtet.

Während B-Zell- und Antikörperreaktionen für eine schützende Wirksamkeit gegen Tuberkulose nicht ausreichen, wird ihre vielfältige komplementäre Rolle bei der T-Zell-vermittelten Immunität zunehmend geschätzt, und diesbezüglich sind weitere klinische Untersuchungen erforderlich24,25,26. Bemerkenswert ist, dass die thermostabile Einzelampullen-Darstellung deutlich mehr Antigen-spezifisches IgG und IgG1 im Serum hervorrief, das zwei bis vier Wochen nach der zweiten Immunisierung gesammelt wurde, als die nicht thermostabile Zweiampullen-Darstellung. Darüber hinaus ergab die Zählung von ID93-spezifischen IgG-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben eine starke Reaktion eine Woche nach der zweiten Immunisierung für die thermostabile Einzelampullen-Darstellung, nicht aber für die nicht-thermostabile Zweiampullen-Darstellung. Es ist nicht klar, wie die unerwarteten Unterschiede im Ausmaß der Immunantworten zwischen den Behandlungsgruppen konkret zugeschrieben werden können. Ein höherer MEPT-Ausgangswert könnte sich auf die Fold-Change-Berechnungen nach der Impfung auswirken, dies erklärt jedoch nicht die Unterschiede in den absoluten MEPT-Werten. Während jede Behandlungsgruppe die gleiche Dosis an Antigen und Adjuvans erhielt, unterschieden sich zwangsläufig andere Faktoren, darunter die Zusammensetzung des Hilfsstoffs, das Herstellungsdatum und die Herstellungsprozesse.

Die in dieser Studie verwendeten zahlreichen immunologischen Tests, Probentypen und Zeitpunkte stellen die bislang umfassendste klinische Immunogenitätsbewertung des ID93 + GLA-SE-Impfstoffkandidaten bei gesunden Erwachsenen dar. Dennoch wies die Studie mehrere Einschränkungen auf, darunter das Fehlen von Placebo-Behandlungsgruppen, die jedoch aufgrund der vorherigen klinischen Bewertung von ID93 + GLA-SE im Vergleich zu ID93 allein oder Placebo mit Kochsalzlösung als unnötig erachtet wurden8,22. Zu den weiteren Einschränkungen gehört, dass keine etablierten Immunkorrelate zum Schutz vor Tuberkulose vorliegen und dass die Teilnehmer weder BCG-geimpft noch mit M. tuberculosis vorexponiert waren. Daher ist es nicht möglich vorherzusagen, wie sich das Immunogenitätsprofil von ID93 + GLA-SE und insbesondere die verstärkten Reaktionen, die durch die thermostabile Impfstoffformulierung hervorgerufen werden, auf die Schutzwirkung auswirken würden. Schließlich wurden in diese Studie auch hauptsächlich weiße Frauen einbezogen, was Hochrechnungen auf andere Bevölkerungsgruppen mit einer hohen Belastung durch Tuberkuloseerkrankungen schwierig macht.

Der Einfluss der thermostabilen Einzelampullenformulierung von ID93 + GLA-SE auf die Skalierbarkeit und die Kosten der Impfstoffherstellung ist ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt. Wir schätzen, dass die Hilfsstoffkosten in der thermostabilen Darreichungsform etwa 0,15 US-Dollar mehr pro Dosis betragen würden als bei der nicht thermostabilen Zusammensetzung im kommerziellen Maßstab. Darüber hinaus wären mit der mehrtägigen Bearbeitungszeit der Lyophilisierung zusätzliche Kosten verbunden. Diese erhöhten Kosten könnten jedoch durch die erwarteten Kosteneinsparungen und die geringere Verschwendung gemildert werden, die mit den weniger strengen Lagerungsanforderungen der thermostabilen Formulierung im Vergleich zur nicht thermostabilen Darreichung verbunden sind. Darüber hinaus ist die Lyophilisierung bereits eine etablierte pharmazeutische Verarbeitungstechnik, die bei der Herstellung vieler zugelassener Impfstoffe eingesetzt wird.

Zusammenfassend zeigte diese klinische Bewertung der Phase 1, dass die thermostabile Einzelampullen-Darstellung von ID93 + GLA-SE ein ähnliches Sicherheitsprofil und ein vergleichbares oder verbessertes Immunogenitätsprofil wie die nicht thermostabile Zweiampullen-Darstellung des Impfstoffs hervorruft. Ein wirksamer thermostabiler Tuberkulose-Impfstoff hätte erhebliche Auswirkungen auf die globale Gesundheit. Darüber hinaus zeigt diese Studie den Proof-of-Concept, dass ein Adjuvans-haltiger Impfstoff in einer thermostabilen Einzelampullenform formuliert werden kann, ohne die klinische Immunogenität oder die Sicherheitseigenschaften zu beeinträchtigen.

Bei dieser Studie handelte es sich um eine randomisierte, doppelblinde klinische Phase-1-Studie zur Bewertung der Sicherheit, Verträglichkeit und Immunogenität von thermostabilem, lyophilisiertem ID93 + GLA-SE in Einzelfläschchen im Vergleich zur nicht thermostabilen Darreichungsform mit zwei Fläschchen, bestehend aus lyophilisiertem ID93 und flüssiges GLA-SE, verabreicht als zwei IM-Injektionen bei gesunden erwachsenen Teilnehmern. Die Studie wurde im Rahmen eines neuen Prüfpräparats (IND) bei der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) durchgeführt und das Protokoll, die Einwilligungserklärung und andere Studienmaterialien wurden vom Institutional Review Board der Saint Louis University genehmigt. Die klinische Studie ist bei ClinicalTrials.gov unter der Kennung NCT03722472 registriert.

Die Studie wurde an einem einzigen Standort durchgeführt (Saint Louis University Center for Vaccine Development in St. Louis, MO) und rekrutierte Teilnehmer aus St. Louis, Missouri und der Umgebung. Wie im Studienprotokoll geplant (Ergänzende Informationen), wurden insgesamt 48 männliche und weibliche Teilnehmer im Alter von 18 bis 55 Jahren und bei allgemein gutem Gesundheitszustand eingeschrieben. Die Teilnehmer wurden im Rahmen der Studie beraten und durchliefen den Prozess der Einwilligung nach Aufklärung. Das Screening umfasste eine Auswertung der Krankengeschichte, der Medikamentengeschichte, eine körperliche Untersuchung, Sicherheitslabortests und eine Urinanalyse. Die vollständigen Einschluss- und Ausschlusskriterien sind in den Zusatzinformationen (Studienprotokoll) aufgeführt. Zu den Zulassungskriterien gehörten gesunde Männer und Frauen im Alter von 18 bis 55 Jahren mit negativem humanem Immundefizienzvirus (HIV), Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) und Hepatitis-C-Virus (HCV) sowie keiner Vorgeschichte einer BCG-Impfung. Teilnehmer, die alle Zulassungskriterien erfüllten, wurden 1:1 in zwei Behandlungsgruppen randomisiert. Studieninjektionen wurden an den Studientagen 0 und 56 durchgeführt. Die allgemeine Sicherheit wurde an den Tagen 0, 7, 56, 63 und 84 für jeden Teilnehmer bewertet. Das Blut wurde am Tag des Screenings sowie an den Studientagen 7 und 63 auf Sicherheitslaboranalysen (Hämatologie und Serumchemie) untersucht. Alle Teilnehmer füllten sieben Tage nach jeder Studieninjektion eine schriftliche Teilnehmergedächtnishilfe aus, die lokale und systemische Reaktogenitäts-UEs erfragte. Unaufgeforderte Nebenwirkungen wurden bis zum 84. Studientag (28 Tage nach der letzten Studieninjektion) erfasst. Das Auftreten von SAEs und das Auftreten etwaiger PIMMCs wurden während des gesamten Studienzeitraums (ca. 421 Tage) aufgezeichnet. Die Immunogenität wurde am Studientag 0 (vor der Dosis) und an den Studientagen 7, 14, 56, 63, 70, 84 und 224 beurteilt. Die Teilnehmer erhielten eine Vergütung von 75 US-Dollar pro Studienbesuch und 10 US-Dollar pro Telefonbesuch.

Die Stichprobengröße von 48 Teilnehmern wurde anhand dessen festgelegt, was für eine Phase-1-Studie angemessen ist, und erlaubt nur vorläufige Sicherheits- und Immunogenitätsinformationen, die für den Übergang zu größeren Studien relevant sind. Basierend auf früheren klinischen Erfahrungen mit der nicht thermostabilen Präsentation von ID93 + GLA-SE schätzten wir, dass eine Stichprobengröße von 24 Teilnehmern pro Gruppe den Nachweis eines Anstiegs der Häufigkeit systemischer Nebenwirkungen um > 32,5 % in der thermostabilen Präsentationsgruppe ermöglichen würde im Vergleich zur nicht-thermostabilen Präsentationsgruppe bei 80 % Leistung mit einem einseitigen Konfidenzintervall von 95 % und Nachweis einer Abnahme der Serumantikörper-Reaktionsrate von >10 % in der thermostabilen Präsentationsgruppe im Vergleich zur nicht-thermostabilen Präsentationsgruppe bei 90 % Leistung mit einem einseitigen Konfidenzintervall von 95 %. An dieser Studie nahmen alle gesunden Erwachsenen teil, die die Einschluss-/Ausschlusskriterien erfüllten, unabhängig vom Geschlecht. Das Geschlecht wurde anhand der Selbstauskunft bestimmt. Es wurden keine geschlechtsspezifischen Analysen durchgeführt, da die Studie nicht ausreichend aussagekräftig war, um diesen Aspekt angemessen zu berücksichtigen. Zu den primären Endpunkten gehörten (1) die Anzahl der Teilnehmer, bei denen innerhalb von 7 Tagen nach jeder Studieninjektion erwünschte lokale Reaktionen an der Injektionsstelle auftraten, (2) die Anzahl der Teilnehmer, bei denen innerhalb von 7 Tagen nach jeder Studieninjektion erwünschte systemische Reaktionen auftraten, (3) die Anzahl der Teilnehmer, die vom Studientag 0 bis zum Studientag 84 spontan unerwünschte Nebenwirkungen meldeten, und (4) die Anzahl der SAEs, die im Zusammenhang mit einer der Studieninjektionen standen, die zu irgendeinem Zeitpunkt während des Studienzeitraums gemeldet wurden. Zu den sekundären Endpunkten gehörten (1) der Anteil der Teilnehmer mit einem mindestens vierfachen Anstieg der IgG-Antikörperreaktionen auf ID93 an den Studientagen 14, 56, 70, 84 und 224 im Vergleich zum Ausgangswert (Studientag 0), wie durch ELISA ermittelt; (2) mittlere fache Veränderung der IgG-Antikörperreaktionen auf ID93 gegenüber dem Ausgangswert an den Studientagen 14, 56, 70, 84 und 224 im Vergleich zum Ausgangswert (Studientag 0), ermittelt durch ELISA; (3) die Anzahl der IFN-γ- und IL-10-Zytokin-sekretierenden Zellen in PBMC-Proben als Reaktion auf ID93 an den Studientagen 14, 56, 70, 84 und 224 im Vergleich zum Ausgangswert (Studientag 0), wie durch ELISpot bestimmt; und (4) der Prozentsatz der CD4+- und CD8+-T-Zellen, die als Reaktion auf ID93 zwei oder mehr Zytokine produzieren, gemessen mittels ICS mit Durchflusszytometrie von PBMCs an den Studientagen 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 und 224. Zu den explorativen Endpunkten gehörten (1) Antikörperreaktionen der IgG-Subklasse auf ID93 an den Studientagen 0, 14, 56, 70, 84 und 224; (2) Nettohemmung des intrazellulären Wachstums von M. tuberculosis unter Verwendung von Vollblut an den Studientagen 0, 70 und 224; (3) IgA-Antikörperreaktionen auf ID93 in Schleimhautsekreten (Nasenabstriche und Tränenflüssigkeit), gemessen mittels ELISA an den Studientagen 0, 70 und 84; (4) Anzahl der Antikörper-sekretierenden Zellen in PBMCs, gemessen mit Kurzkultur-B-Zell-ELISpot an den Studientagen 0, 7, 56 und 63; (5) die Anzahl der Antigen-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs, gemessen mit dem Langzeitkultur-B-Zell-ELISpot an den Studientagen 0, 56, 84 und 224; und (6) der Prozentsatz von Tfh-Zellen und T-Zell-Homing-Markern in PBMCs, gemessen durch immunphänotypisierende Durchflusszytometrie an den Studientagen 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 und 224.

Die Teilnehmer wurden durch Randomisierung gemäß den folgenden Schritten in zwei Behandlungsgruppen eingeschrieben. Es wurde ein Hauptprotokoll aller überprüften Teilnehmer geführt. Beim Screening wurden Teilnehmer, die die Einverständniserklärung unterschrieben hatten und alle Einschluss- und keines der Ausschlusskriterien erfüllten, als für die Teilnahme an der Studie geeignet identifiziert. Berechtigten Teilnehmern wurde eine fortlaufende Identifikationsnummer zugewiesen, als sie sich am Studientag 0 in der Klinik vorstellten. Statistiker von DF/Net Research (Seattle, WA) erstellten die Liste der randomisierten Behandlungszuweisungen und fügten sie in das Registrierungsmodul des Interactive Web Randomization System ein (IWRS), das in die DFexplore-Software integriert ist. Der Studienkoordinator oder Beauftragte am klinischen Standort führte die Registrierung und Randomisierung mithilfe von DFexplore durch. Mithilfe einer Blockrandomisierung geeigneter Größe wurde sichergestellt, dass die Einschreibung in jeder der beiden Gruppen im Verhältnis 1:1 ausgeglichen war. Einer bestimmten Person am Studienort wurde ein Behandlungsschlüssel ausgehändigt, der den Behandlungscode mit der tatsächlichen Behandlungsaufgabe verknüpfte und an einem sicheren Ort aufbewahrt wurde.

Die Studie wurde als Doppelblindstudie durchgeführt. Teilnehmer, Prüfärzte, Studienpersonal, das nach der Studieninjektion studienbezogene Beurteilungen durchführte, und Laborpersonal, das immunologische Tests durchführte, waren hinsichtlich der Behandlungszuweisung blind. Das Randomisierungsschema von DF/Net Research wurde dem nicht verblindeten Studienpersonal zur Verfügung gestellt (d. h. den Apothekern vor Ort, die die Vorbereitung der Studienprodukte durchführten, und den Administratoren der nicht verblindeten Studienprodukte).

ID93 ist ein rekombinantes Untereinheit-Antigen und GLA-SE ist eine Squalenemulsion, die den synthetischen Toll-like-Rezeptor-4-Agonisten Glucopyranosyllipid A (GLA) enthält8,27. Dies war die fünfte klinische Studie, in der der Impfstoff ID93 + GLA-SE menschlichen Teilnehmern verabreicht wurde, aber die erste für die thermostabile Einzelampullenpräsentation (NCT01599897, NCT01927159, NCT02465216, NCT02508376 und NCT03722472). Die Ergebnisse einer früheren Studie dienten als Grundlage für die Dosisauswahl (2 µg ID93 und 5 µg GLA-SE) und den Zeitplan für diese Studie8. Die thermostabile lyophilisierte Einzelampullenpräsentation von ID93 + GLA-SE wurde wie zuvor beschrieben entwickelt und hergestellt, einschließlich der Optimierung des Hilfsstoffgehalts, der Technik des Lyophilisierungsprozesses und einer umfassenden Überwachung der physikalisch-chemischen und Wirksamkeitsstabilität12,13. Das thermostabile lyophilisierte Einzelfläschchen ID93 + GLA-SE wurde vor der Verabreichung mit sterilem Wasser für Injektionszwecke (WFI) rekonstituiert. Die nicht thermostabile Zwei-Fläschchen-Darstellung wurde durch Rekonstitution von lyophilisiertem ID93-Protein mit sterilem WFI und Mischen im Verhältnis 1:1 v:v mit flüssigem GLA-SE vor der Verabreichung hergestellt. Für die Präsentation in zwei Fläschchen wurde ID93 vom University of Iowa Center for Biocatalysis and Bioprocessing (CBB, Coralville, IA) hergestellt und die Lyophilisierung wurde von der University of Iowa Pharmaceuticals (Iowa City, IA) durchgeführt. Flüssiges GLA-SE wurde vom Infectious Disease Research Institute (IDRI; Seattle, WA), heute Access to Advanced Health Institute (AAHI), hergestellt. Für die Einzelampullenpräsentation wurden die Arzneimittelsubstanzen ID93 und GLA-SE in großen Mengen bei CBB bzw. IDRI hergestellt, und das endgültige Arzneimittelprodukt wurde bei Lyophilization Technology, Inc (Warminster, PA) hergestellt. Alle Prüfprodukte wurden dem Prüfer (Daniel F. Hoft an der Saint Louis University) vom Sponsor (IDRI) zur Verfügung gestellt. Fläschchen mit ID93 + GLA-SE, ID93 und GLA-SE wurden versandt und am Studienort bei 2–8 °C gelagert; Die Temperatur während des Transports und der Lagerung wurde kontinuierlich überwacht. Steriles WFI wurde vom Studienzentrum bereitgestellt.

Die Vorbereitung des Studienimpfstoffs, einschließlich der Impfstoffverdünnungen und des Mischens für die beiden Dosierungsgruppen, wurde vom Apotheker am nicht verblindeten Standort unter Verwendung einer aseptischen Technik am selben Tag der Verabreichung des Studienimpfstoffs, jedoch nicht mehr als 2 Stunden vor der Verabreichung, durchgeführt. Nach der Rekonstitution sah der Impfstoff aus beiden Behandlungsgruppen (Einzel- und Doppelampullen) identisch aus. Der mit der Verabreichung der Studieninjektionen beauftragte Beauftragte erhielt eine geladene Spritze, auf der die Identifikationsnummer des Teilnehmers und die im Krankenhaus erforderlichen Identifikationsdaten aufgedruckt waren. Der Zeitpunkt der Vorbereitung und der Verabreichung wurde in der Quellendokumentation vermerkt. Alle Studieninjektionen hatten ein Volumen von 0,5 ml und wurden intramuskulär in den Deltamuskel des nicht dominanten Arms verabreicht.

Alle Proben wurden am Studienort gesammelt, protokolliert und nachverfolgt (Saint Louis University Center for Vaccine Development in St. Louis, MO). Sicherheitsproben wurden noch am selben Tag als Sammlung an Quest Diagnostics, ehemals LabOne (Lenexa, KS), zur Verarbeitung versandt. Immunologische Proben für sekundäre und explorative Endpunkte wurden an der Saint Louis University verarbeitet. Serum- und PBMC-Proben jedes Teilnehmers wurden hier bis zum Abschluss der Studie gelagert. Anschließend wurden die Proben zur Untersuchung und Analyse in zwei separaten Sendungen an Advanced Bioscience Laboratories (ABL Inc.; Rockville, MD) geschickt, um das Risiko eines Probenverlusts zu verringern aufgrund von Temperaturschwankungen. PBMCs wurden mit mit flüssigem Stickstoff beladenen Trockenschiffen verschickt, und Serumproben wurden auf Trockeneis verschickt.

Für den Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)-Assay wurde Blut mit sterilen Natriumheparin-Sammelröhrchen gesammelt. Für hämatologische Sicherheitstests wurde Blut in Röhrchen mit EDTA gesammelt. Um Serumproben für die Sicherheitschemie und Antikörperanalyse zu erhalten, wurde Blut mithilfe von Serumtrennröhrchen (SST) gesammelt. Für die Antikörperanalyse wurde der Überstand nach 10–15-minütiger Zentrifugation bei 750–930 × g bei Umgebungstemperatur gesammelt. Serumproben mit jeweils ~500 µL wurden aufgeteilt (in zwei Primär- und zwei Backup-Fläschchen), in vorgekühlte 9 × 9-Kryoboxen gegeben, sofort bei –70 °C ± 10 °C eingefroren und in aufrechter Position bei –70 °C gelagert °C ± 10 °C bis zum Versand an ABL.

Um PBMC-Proben zu erhalten, wurde Blut in 8-ml-CPT-Röhrchen (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) gesammelt. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 1800 × g bei Umgebungstemperatur in einer Zentrifuge mit horizontalem Rotor und ausschwenkbarem Kopf wurde Plasma abgesaugt, die Zellschicht mit einer Pipette aus dem Röhrchen gesammelt und in ein konisches Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. PBMC-Proben wurden anschließend im Verhältnis 8 × 106 in 1 ml Gefriermedium (fötales Rinderserum (FBS) mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)) pro Kryoröhrchen aliquotiert. PBMCs wurden sofort in CoolCell- (Corning, Corning, NY) oder Mr. Frosty- (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) Behältern bei –70 ° C ± 10 ° C eingefroren. Die PBMC-Fläschchen jedes Teilnehmers wurden in zwei separaten (Primär- und Backup-) vorgekühlten 9 × 9-Kryoboxen in aufrechter Position in einem Gefrierschrank verteilt, dann innerhalb einer Woche in einen kryogenen Gefrierschrank mit flüssigem Stickstoff oder Dampfphase überführt und dort bis zum Versand gelagert ABL.

Zur Entnahme von Nasenproben wurde derselbe sterile PurFlock-Tupfer (Puritan Medical Products, Guilford, ME) in jede Nasenhöhle entlang der Nasenscheidewand eingeführt und um 360° in jede Richtung gedreht, wobei nach jeder Drehung 5 Sekunden gewartet wurde, bevor der Tupfer vorsichtig entfernt wurde. Nach der Probenahme aus beiden Nasenlöchern wurde die Tupferspitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen in 3 ml Puffer gegeben, der Dulbecco's PBS (DPBS) mit 5 mM l-Glutaminsäure und 10 % Saccharose (pH 7,2) enthielt. Der Tupfer-Applikatorstab wurde entfernt und der Tupfer blieb im Röhrchen. Nasenabstrichproben wurden bis zum Einfrieren bis zu 2 Stunden lang auf nassem Eis oder in einem Kühlschrank bei 2–8 °C aufbewahrt. Die Proben wurden bei –70 °C ± 10 °C eingefroren und bis zur Verarbeitung mindestens 24 Stunden, jedoch nicht länger als 1 Monat bei dieser Temperatur gelagert. Die Probenverarbeitung bestand darin, das Röhrchen eine Minute lang zu verwirbeln und dann den Tupfer vor dem Entfernen gegen die Seite des Röhrchens zu drücken. Die verbleibende Probe wurde dann in Kryoröhrchen aliquotiert und bis zur Analyse an der Saint Louis University bei –70 °C ± 10 °C gelagert.

Tränenproben wurden gesammelt, indem zunächst eine Orangenschale direkt über das Auge des Teilnehmers gedrückt wurde. Anschließend blinzelte der Teilnehmer mehrmals, bis ihm Tränen in die Augen kamen. Die Tränen (Zielvolumen 125 µL) wurden mit einem Kapillarröhrchen gesammelt, das in ein Sammelmikroröhrchen mit Schraubverschluss ablief. Anschließend wurde das betroffene Auge mit einer Augenspüllösung und einer handelsüblichen Augentropfenlösung gespült. Tränenproben wurden bis zu 2 Stunden lang auf nassem Eis gehalten, bevor sie durch 5-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g und ~4 °C verarbeitet wurden. Der Überstand wurde in 15-µL-Aliquoten gesammelt, in 0,5-ml-Aufbewahrungsfläschchen gegeben und bis zur Analyse an der Saint Louis University bei –70 °C ± 10 °C gelagert.

Das Auftreten aller UE wurde bis zum 84. Studientag aufgezeichnet, während SAEs und PIMMCs bis zum 421. Studientag überwacht wurden. Die UE wurden nach Schweregrad (d. h. Grad 1, 2 oder 3) und nach Beziehung zur Studieninjektion (d. h. nicht) eingestuft , möglicherweise, wahrscheinlich oder definitiv verwandt) gemäß den Definitionen im Studienprotokoll (Ergänzende Informationen). Für Berichtszwecke wurden im Einklang mit den Richtlinien des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) definitiv, wahrscheinlich und möglicherweise damit verbundene unerwünschte Ereignisse im Zusammenhang mit der Studieninjektion betrachtet. Nicht zusammenhängende Nebenwirkungen wurden als nicht zusammenhängend betrachtet. Ein SUE wurde als jedes UE definiert, das zum Tod führte, als lebensbedrohlich galt, einen Krankenhausaufenthalt oder eine Verlängerung des Krankenhausaufenthalts erforderte, zu einer dauerhaften oder erheblichen Behinderung/Unfähigkeit führte oder zu einer angeborenen Anomalie/einem Geburtsfehler bei den Nachkommen eines Studienteilnehmers führte .

Lokale Reaktionen an der Injektionsstelle wurden am Tag der Studieninjektion (vor der Injektion und 60 Minuten nach der Injektion) und 7 Tage nach der Studieninjektion anhand der Einstufung von Schmerz, Erythem und Verhärtung beurteilt. Erforderliche systemische Reaktionen wurden definiert als das Auftreten von Kopfschmerzen, Arthralgie, Schüttelfrost, Appetitlosigkeit, Fieber, Müdigkeit und/oder Myalgie in den 7 Tagen nach jeder Studieninjektion. Diese Symptome wurden als Grad 1 (leicht), Grad 2 (mäßig) oder Grad 3 (schwer) charakterisiert. An jeden Teilnehmer wurden Erinnerungsbroschüren verteilt, um lokale und systemische AE-Informationen für den Zeitraum von 7 Tagen nach jeder Studieninjektion zu sammeln. Alle Teilnehmer wurden angewiesen, die Mundtemperatur sowie lokale und allgemeine Anzeichen und Symptome am Abend des Injektionstages und in den 6 Tagen nach den Studieninjektionen täglich etwa zur gleichen Zeit auf individuellen Gedächtnisstützen aufzuzeichnen. Erythem und Verhärtung an der Injektionsstelle wurden mit dem mitgelieferten Messgerät gemessen und bewertet. Die Teilnehmer wurden außerdem gebeten, die eingenommenen Medikamente zu dokumentieren. Die Erinnerungshilfe wurde zum geplanten Besuch 7 Tage nach jeder Injektion zur Überprüfung in die Klinik gebracht und vom Studienforschungspersonal an den Studientagen 7 und 63 abgeholt. Die Erinnerungshilfe war ein Hilfsmittel, das dem Prüfer und/oder dem Beauftragten helfen sollte, sich zu engagieren im Gespräch mit dem Teilnehmer über etwaige Nebenwirkungen, die nach Injektionen aufgetreten sein könnten.

Puls, orale Temperatur, Atemfrequenz sowie systolischer und diastolischer Blutdruck wurden an den Studientagen 0, 7, 56, 63 und 84 bestimmt. Sicherheitslabortests (Hämatologie und Serumchemie) wurden 7 Tage nach jeder Injektion durchgeführt. Veränderungen der Vitalfunktionen oder Labortestwerte, die Grad 1 oder höher erreichten, wurden als UE erfasst. In der Studienklinik wurden Urin-Schwangerschaftstests mit einem kommerziellen Test durchgeführt. Beim Screening wurde eine Serologie auf HIV, HBsAg, HCV und QuantiFERON-TB Gold durchgeführt. Außerplanmäßige Nachuntersuchungen im Labor wurden nach Ermessen des Studienarztes durchgeführt. Alle serologischen, hämatologischen und chemischen Tests wurden bei Quest Diagnostics durchgeführt.

Bei dieser klinischen Studie wurde ein Safety Monitoring Committee (SMC) eingesetzt, um die Sicherheit der Probanden und die Kriterien für den Studienabbruch zu überwachen. Das SMC traf sich ein Jahr nach Beginn der Studie, um den aktuellen Studienstatus zu überprüfen und den bisherigen Sicherheitszusammenfassungsbericht zu besprechen. Zu diesem Zeitpunkt wurden keine wesentlichen Sicherheitsbedenken festgestellt. Daher empfahl das SMC, die Studie wie geplant und ohne Änderungen fortzusetzen.

Alle Immunogenitätsbewertungen von Serum- und PBMC-Proben wurden von ABL durchgeführt. Serum-ELISAs wurden unter Verwendung von hochbindenden 384-Well-ELISA-Platten durchgeführt, die 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur entweder mit gereinigtem ID93 oder Untereinheitsproteinen (RV1813, RV2608, RV3619 oder RV3620) beschichtet wurden, jeweils 1 µg pro ml. Anschließend wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer A (Teknova, Hollister, CA) gewaschen und 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur mit Blockierungspuffer (1 % w/v Rinderserumalbumin [BSA] und 0,05 % w/v Polysorbat 20 in PBS) blockiert ). Der Blockierungspuffer wurde dann verworfen und Proben wurden in jede Vertiefung gegeben. Das Kontrollserum wurde vierfach verdünnt, beginnend mit einer anfänglichen 1:100-Verdünnung in 0,1 % BSA mit 0,05 % Polysorbat 20 in PBS, in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten sieben Mal gewaschen, bevor mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte Sekundärantikörper (spezifische Antikörper und Verdünnungen siehe Ergänzende Hinweise) gemäß dem durchgeführten spezifischen ELISA in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei Umgebungstemperatur inkubiert wurden. Anschließend wurden die Platten sieben Mal gewaschen, durch Zugabe von SureBlue TMB-Peroxidase-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories [KPL], Gaithersburg, MD) kolorimetrisch entwickelt, etwa 10 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert und mit 1 N Schwefelsäure gestoppt. Optische Dichten (ODs) wurden bei 450 und 570 nm mit einem Plattenlesegerät (Molecular Devices) quantifiziert. Subtrahierte OD-Daten (450–570 nm) wurden zur Durchführung nachfolgender Datenanalysen verwendet. Die Endpunkttiter wurden berechnet, indem bei jeder Verdünnung eine Kleinste-Quadrate-Anpassung der OD-Werte an eine sigmoidale Kleinste-Quadrate-Kurve mit vier Parametern durchgeführt wurde. Die Cutoff-Werte wurden als Durchschnitt der negativen Kontrollseren bei allen Verdünnungen plus dem Sechsfachen oder Dreifachen der Standardabweichung je nach Antikörperisotyp berechnet. Proben mit OD-Werten unter dem Grenzwert wurde ein Endpunkttiter von 1,699 zugewiesen, was der logarithmischen Transformation des 0,5-fachen der niedrigsten Verdünnung entspricht.

ELISAs für sekretorisches Immunglobulin A (sIgA) wurden mit einem Nasenabstrich und Tränenproben durchgeführt, die an den Studientagen 0, 70 und 22428 gesammelt wurden. Für den Antigen-spezifischen sIgA-ELISA wurden Immulon 2-Platten mit 1 µg pro ml gereinigtem ID93-Protein (AAHI) beschichtet , Seattle, WA) in PBS verdünnt und über Nacht bei 4 °C, 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit PBS plus 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen und mit 1 % BSA in PBS etwa 1 Stunde lang bei 37 °C blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Platten gewaschen, Nasenabstrich- und Tränenproben wurden in den Duplikatvertiefungen mit optimalen Verdünnungen, die für jeden Probentyp festgelegt waren, hinzugefügt und die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden dann mit PBS plus 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen und unter Zugabe von Biotin-konjugiertem, gereinigtem Ziegen-Anti-Human-IgA (Kat.-Nr. 5260-0027, KPL, Seracare Life Sciences) in 500-facher Verdünnung 1,5 Stunden lang inkubiert Bei Raumtemperatur vor Licht geschützt aufbewahren. Nach der Inkubation wurden die Platten mit PBS plus 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen, mit Phosphatase markiertes Streptavidin (KPL) hinzugefügt und die Platten 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde eine pNPP-Substratlösung (SIGMAFAST p-Nytrophenylphosphat-Tabletten, MilliporeSigma) hergestellt, dann wurden die Platten mit PBS plus 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen und die Substratlösung hinzugefügt. Die Platten mit Substratlösung wurden 50 Minuten lang inkubiert (bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt), AP-Stopplösung (KPL) wurde zugegeben und die Absorption wurde bei einer Doppelwellenlänge von 405/550 abgelesen. Der gesamte sIgA-ELISA wurde gemäß dem Protokoll des IgA (Human) ELISA Kit (Abnova, Taipei, Taiwan; #KA2110) durchgeführt.

ICS wurde gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt. PBMCs von Studienteilnehmern wurden aufgetaut und in R10-Medium (RPMI 1640 mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptavidin) bei einer maximalen Konzentration von 2 × 106 Zellen pro ml über Nacht bei 37 °C und 5 °C ruhen gelassen % CO2. PBMCs wurden dann auf eine Konzentration von 10 × 106 Zellen pro ml resuspendiert und so verteilt, dass jeweils 1 × 106 Zellen pro ml mit 0,25 μg pro ml Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) oder 10 μg pro ml ID93 oder 0,3 % DMSO stimuliert wurden Außerdem wurde jeweils ein CD28/CD49d-Costimulationscocktail hinzugefügt. Nachdem PBMCs 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert wurden, wurde 1X Brefeldin A zugegeben, um sekretorische Proteine (z. B. Zytokine und Interleukine) intrazellulär zurückzuhalten. Die Aktivierung wurde weitere 10 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 fortgesetzt, wobei die Zellen in einem versiegelten Plastikbeutel mit einem feuchten Handtuch inkubiert wurden. Zellzahlen und prozentuale Lebensfähigkeit wurden mit dem Guava EasyCyte-Durchflusszytometer (Luminex, Austin, TX) überwacht. Die Zellen wurden dann in mehreren Stufen gefärbt, um nach Regionen/Zonen unterteilte Ziele zu erkennen. Die Zellen wurden separat gefärbt: zuerst mit einer 500-fachen Verdünnung des Lebensfähigkeitsfarbstoffs (Human CD14 BV510, Kat.-Nr. 301842, BioLegend) für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur, gefolgt von 5 µg pro ml menschlichem Fc-Block für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur (geschützt vor Licht) und dann mit einem extrazellulären Oberflächenmarker-Cocktail für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur. Eine vollständige Liste der verwendeten Antikörper und Verdünnungen sowie anderer Reagenzien finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen. Als nächstes wurden die Zellen permeabilisiert und mit BD CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences) für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur (lichtgeschützt) fixiert, gefolgt von 1X Perm/Wash-Pufferwaschungen. Abschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur (lichtgeschützt) mit einem intrazellulären Markercocktail gefärbt, 20 Minuten lang bei Umgebungstemperatur mit 1X BD Stabilizing Fixative fixiert und innerhalb von 16 Stunden nach der Färbung auf dem BD LSRFortessa-Durchflusszytometer analysiert. Daten zu Zellpopulationszahlen und -häufigkeiten wurden mit der Software FlowJo v10.8.1 (BD Biosciences) gesammelt.

Ein kurzfristiger B-Zell-ELISpot-Assay wurde durchgeführt, um die Häufigkeit zirkulierender Antikörper-sezernierender Zellen zu ermitteln. Die Platten wurden mit 35 %igem Alkohol aktiviert und die entsprechenden Vertiefungen entweder mit ID93-Fängerantigen oder IgG/IgA-Fängerantikörper beschichtet (Klon MT91/145, Kat.-Nr. 3850-3-1000 bzw. Klon MT57, Kat.-Nr. 3860-3-1000). MabTech) bei 100-facher Verdünnung und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit R10-Medium blockiert. PBMCs wurden aufgetaut, 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert und vor der Aussaat in blockierten Vertiefungen gezählt (5 × 105 Zellen pro Vertiefung für ID93 oder 1 × 105 Zellen pro Vertiefung für IgG/IgA). Die Zellen wurden 18–22 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit Anti-IgG- oder Anti-IgA-Nachweisantikörpern (Klon MT78/145, Kat.-Nr. 3850-6-250 bzw. Klon MT20, Kat.-Nr. 3860-6-250, MabTech) 500-fach inkubiert Verdünnung für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur, gewaschen, mit Anti-Biotin-Streptavidin-alkalische Phosphatase (AP)-Sekundärantikörper (Kat.-Nr. 3310-9-1000, MabTech) für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert, gewaschen und schließlich mit Nitro- entwickelt. Blaues Tetrazolium/5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat (NBT/BCIP) für 7 Minuten bei Umgebungstemperatur, bevor mit destilliertem Wasser gestoppt wird. Innerhalb von 2 Tagen nach der Entwicklung wurden die Platten gescannt, gezählt und einer Qualitätskontrolle mit dem ImmunoSpot-Analysegerät (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH) unterzogen.

Ein Langzeit-B-Zell-ELISpot-Assay zum Nachweis von Gedächtnis-B-Zellen wurde nach den gleichen oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass PBMCs zunächst drei Tage lang mit R10-Medium, ergänzt mit polyklonalem B-Zell-Resiquimod/IL-2 vom Typ Human B-Poly-S, kultiviert wurden Stimulator (Cellular Technology Limited) getestet und dann ausplattiert (2 × 105 Zellen pro Vertiefung für ID93 oder 5 × 104 Zellen pro Vertiefung für IgG/IgA) und am 4. bzw. 5. Tag entwickelt.

IFN-γ- und IL-10-T-Zell-ELISpot-Assays wurden gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt. Die Platten wurden mit 35 % Alkohol aktiviert und mit Fängerantikörpern gegen IFN-γ oder IL-10 (Klon 1-D1K, Kat.-Nr. 3420-3-250 bzw. Klon 9D7, Kat.-Nr. 3430-3-250) beschichtet. MabTech) bei 100-facher Verdünnung und über Nacht bei 4 °C inkubiert. PBMCs der Studienproben und Spenderkontroll-PBMCs des Zytomegalievirus, des Epstein-Barr-Virus, des Influenzavirus und des Tetanustoxins (CEFT) wurden aufgetaut, gezählt und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Platten durch Zugabe von R10-Medium blockiert und 2–4 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert. Die Studienproben und Kontroll-PBMCs wurden erneut gezählt und auf geeignete Konzentrationen resuspendiert. Die Zellen wurden gemäß den folgenden Dichten auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Alle Studienproben wurden für beide T-Zell-ELISpot-Tests mit 2 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Spenderkontroll-PBMCs wurden entweder mit 2 × 105 Zellen pro Vertiefung zur Phytohämagglutinin (PHA)-Stimulation (IL-10-Assay) oder mit 1 × 105 Zellen pro Vertiefung zur CEF-Stimulation (IFN-γ-Assay) ausgesät. Den entsprechenden Vertiefungen wurden Stimulanzien in den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 10 µg pro ml ID93; 1 µg pro ml RV1813-, RV2608-, RV3619- oder RV3620-Peptide; 1–10 µg pro ml PHA; oder 1 µg pro ml CEF. Die zusammengesetzten Platten wurden über Nacht 18–22 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit 1 µg pro ml Anti-Human-IFN-γ- oder Anti-Human-IL-10-Nachweisantikörper (Klon 7-B6-1, Kat.-Nr. 3420-6-250 oder Klon 12G8, Kat.-Nr. 3430) inkubiert -6-250 bzw. MabTech) bei 1000-facher Verdünnung für 2,5 Stunden bei Umgebungstemperatur, gewaschen, mit Streptavidin-HRP für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert, gewaschen und schließlich mit NovaRED (Vector Laboratories, Newark, CA) entwickelt. für ca. 15 Minuten bei Umgebungstemperatur, bevor mit destilliertem Wasser gestoppt wird. Innerhalb von 1–2 Tagen nach der Entwicklung wurden die Platten gescannt, gezählt und einer Qualitätskontrolle mit dem ImmunoSpot-Analysegerät unterzogen.

Die mykobakterizide Aktivität wurde wie zuvor beschrieben in Vollblutkulturen vom Tag 0, 7 und 224 untersucht29. Kurz gesagt wurde RPMI 1640-Medium mit L-Glutamin und HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure) verwendet, um die heparinisierten Vollblutproben zu verdünnen. Anschließend wurden diese verdünnten Vollblutproben in 2-ml-Röhrchen mit hinzugefügt BCG (in Duplikaten) und dicht verschlossen. Anschließend wurden die Röhrchen auf einen Rotator gestellt und 72 Stunden lang bei 37 °C kontinuierlich gedreht. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das verbleibende Pellet aus jedem Röhrchen wurde in mit PANTA ergänztem Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)-Medium (BD) resuspendiert, gründlich gevortext und dann in ein fluorimetrisches MGIT (BD) überführt. Die MGITs mit Proben wurden fest verschlossen und in ein Bactec MGIT 320-Gerät (BD) gegeben. Die Zeit bis zur Positivität (TTP) von MGITs wurde automatisch verfolgt und aufgezeichnet.

Die immunologische Analyse wurde entweder mit Prism 9.3 oder höher (GraphPad Software, San Diego, CA), SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) oder R 4.03 (The R Foundation, Wien, Österreich) durchgeführt. Kategoriale Daten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests und eines Signifikanzniveaus von 0,05 (α = 0,05) mit Bonferroni-Anpassungen analysiert, wann immer paarweise Vergleiche zwischen mehr als zwei Kategorien durchgeführt wurden.

Kontinuierliche Daten zwischen zwei Behandlungsgruppen wurden mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests verglichen, da die Normalitätsannahme für keinen Datensatz gemäß dem Shapiro-Wilk-Test erfüllt war. Die Rücklaufquoten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests verglichen. Unterschiede wurden auf der Grundlage eines zweiseitigen Tests und p ≤ 0,05 (α = 0,05) mit Bonferroni-Anpassungen festgestellt, wann immer paarweise Vergleiche zwischen mehreren Zeitpunkten durchgeführt wurden. Die Vergleiche wurden von der Punktschätzung und dem 95 %-Konfidenzintervall (KI) für jede Gruppe begleitet. Es wurde davon ausgegangen, dass fehlende Daten vollständig zufällig (MCAR) fehlten, und die verfügbaren Daten wurden analysiert.

IgG-Antikörperreaktionen (Gesamt-IgG, IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) auf das ID93-Antigen wurden mittels ELISA unter Verwendung von Serum gemessen, das einem bestimmten Teilnehmer entnommen wurde. Zu jedem Zeitpunkt wurde der aus Duplikaten berechnete MEPT gemeldet. Zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion wurde das folgende Post:Pre-Verhältnis berechnet:

Ein Teilnehmer galt zu einem bestimmten Zeitpunkt als Antikörper-positiv-Responder, wenn die Systemeignungskriterien für einen bestimmten ELISA erfüllt waren und das Post:Pre-Verhältnis zu diesem Zeitpunkt ≥4 betrug.

Die zellulären Reaktionen auf das ID93-Protein wurden durch Messung der Zytokinproduktion in PBMCs mittels ELISpot-Assay und mittels ICS mit Durchflusszytometrie bewertet. IFN-γ- und IL-10-ELISpot-Assays wurden an Proben der Studientage 0, 14, 56, 70, 84 und 224 durchgeführt, um den Anteil der PBMCs zu bestimmen, die IFN-γ oder IL-10 als Reaktion auf Stimulation mit ID93 oder unstimuliert produzieren (PBS). Zur Analyse wurden vom Hintergrund subtrahierte SFU-Werte (Spot Forming Units) berechnet. Zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion wurde die Änderung gegenüber dem Ausgangswert berechnet, indem der vom Hintergrund subtrahierte SFU-Wert zum Ausgangswert von einem bestimmten Zeitpunkt abgezogen wurde. Sowohl der vom Hintergrund abgezogene SFU als auch die Änderung gegenüber dem Ausgangs-SFU wurden für jeden Teilnehmer und jeden Besuchstag zusammengefasst. Der Responder-Status zu jedem Zeitpunkt wurde mithilfe des MIMOSA-Modells bestimmt, einem bayesianischen statistischen Rahmen, der die Falscherkennungsrate auf 0,1 % kontrolliert30. Die Markov-Ketten-Monte-Carlo-Einstellungen (MCMC) verwendeten den Standard-Hyperparameter. Insbesondere wurde angenommen, dass sowohl die Non-Responder- als auch die Responder-Wahrscheinlichkeiten der Betaverteilung folgen, wobei den Hyperparametern vage exponentielle Prioritäten mit einem Mittelwert von 1000 zugewiesen wurden. Es wurde angenommen, dass der unbekannte Anteil der Responder aus einer gleichmäßigen Verteilung zwischen 0 und 1 stammt Der MCMC-Lauf verwendete 200.000 Iterationen nach 50.000 Einbrenn-Iterationen. Die Responder-Rate wurde dann basierend auf der Gesamtzahl der analysierten Teilnehmer in jeder Behandlungsgruppe berechnet.

PBMC ICS wurde an Proben der Studientage 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 und 224 durchgeführt, um den Anteil einzelner und multifunktionaler CD4- und CD8-T-Zellen zu bestimmen, die verschiedene Kombinationen von IFNγ, TNF, IL- produzieren. 2, IL-4, IL-21 und CD154 als Reaktion auf die ID93-Stimulation. Für jeden Funktionsmarker wurde ein Gate angewendet, wobei die Koexpression anderer Marker nicht berücksichtigt wurde (Ergänzende Abbildungen 6–10). Basierend auf den gezeigten Gattern wurden später boolesche Gatter erstellt, um Zellen zu identifizieren, die verschiedene Kombinationen von Markern exprimieren. Wir analysierten die T-Zellpopulation auf zwei oder mehr Zytokine, die positiv auf mindestens zwei Immunmarker unter IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-21 und CD154 waren. Wir haben auch T-Zellen untersucht, die ausgewählte Kombinationen der sechs Immunmarker exprimierten. Alle negativen, vom Hintergrund subtrahierten Werte wurden auf Null gesetzt. Die vom Hintergrund abgezogene Häufigkeit (%) wurde als Häufigkeit von Zytokin-positiven T-Zellen für die ID93-stimulierten Proben abzüglich der nicht stimulierten Proben (abgezogen vom Hintergrund) berechnet.

Zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion wurde die Änderung gegenüber dem Ausgangswert berechnet, indem die vom Hintergrund abgezogene Häufigkeit (%) zum Ausgangswert von einem bestimmten Zeitpunkt abgezogen wurde. Für jeden Teilnehmer und jeden Besuchstag wurden sowohl die vom Hintergrund abgezogenen Frequenzen als auch die Änderungen gegenüber den Ausgangsfrequenzen zusammengefasst. Der Antwortstatus wurde für jeden Teilnehmer, jeden Besuchstag und jede T-Zell-Untergruppe mithilfe des MIMOSA-Modells bestimmt. Die Responder-Rate wurde dann basierend auf der Gesamtzahl der analysierten Teilnehmer in jeder Behandlungsgruppe berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Einzelne Teilnehmerdaten stehen jedoch nicht zur Verfügung, da die Einwilligung nach Aufklärung dies nicht ausdrücklich beinhaltete. Das Studienprotokoll, die Disposition der Studienteilnehmer und Protokollabweichungen sind in den Zusatzinformationen enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Weltgesundheitsorganisation. Factsheet zum globalen Tuberkulosebericht 2021. https://www.who.int/publications/m/item/factsheet-global-tb-report-2021 (2021).

Trunz, BB, Fine, P. & Dye, C. Wirkung der BCG-Impfung auf tuberkulöse Meningitis und Miliartuberkulose im Kindesalter weltweit: eine Metaanalyse und Bewertung der Kostenwirksamkeit. Lancet 367, 1173–1180 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Katelaris, AL et al. Wirksamkeit der BCG-Impfung gegen Mycobacterium tuberculosis-Infektionen bei Erwachsenen: eine Querschnittsanalyse einer im Vereinigten Königreich ansässigen Kohorte. J. Infizieren. Dis. 221, 146–155 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Harvey, M. et al. Kritischer Mangel in der BCG-Immuntherapie: Wie sind wir hierher gekommen und wohin wird uns das führen? Urol. Onkol. 40, 1–3 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bloom, BR Neues Versprechen für Impfstoffe gegen Tuberkulose. N. engl. J. Med. 379, 1672–1674 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Tait, DR et al. Abschließende Analyse einer Studie mit dem M72/AS01E-Impfstoff zur Vorbeugung von Tuberkulose. N. engl. J. Med. 381, 2429–2439 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Frick, M. Pipeline-Bericht. https://www.treatmentactiongroup.org/wp-content/uploads/2021/10/2021_pipeline_TB_vaccines_final.pdf (2021).

Day, TA et al. Sicherheit und Immunogenität des therapeutischen Zusatzimpfstoffs ID93 + GLA-SE bei Erwachsenen, die eine Tuberkulosebehandlung abgeschlossen haben: eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Phase-2a-Studie. Lanzettenatmung. Med. 9, 373–386 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, BY et al. Wirtschaftliche Auswirkungen thermostabiler Impfstoffe. Vaccine 35, 3135–3142 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Preston, KB & Randolph, TW Stabilität lyophilisierter und sprühgetrockneter Impfstoffformulierungen. Adv. Drogenlieferung Rev. 171, 50–61 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Qi, Y. & Fox, CB Entwicklung thermostabiler Impfstoffadjuvantien. Expert Rev. Vaccines 20, 497–517 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kramer, RM et al. Entwicklung eines thermostabilen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs gegen Tuberkulose unter Verwendung eines Design-of-Experiment-Ansatzes. Int. J. Nanomed. 13, 3689–3711 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Dutill, TS et al. Lyophilisierungsverfahrenstechnik und Thermostabilität von ID93 + GLA-SE, einem Adjuvans-Untereinheiten-Tuberkulose-Impfstoffkandidaten in Einzelfläschchen zur Verwendung in klinischen Studien. Vorderseite. Drogenlieferung 2, 1–19 (2022).

Artikel Google Scholar

Schrager, LK, Vekemens, J., Drager, N., Lewinsohn, DM & Olesen, OF Der Stand der Entwicklung von Tuberkulose-Impfstoffen. Lanzetteninfektion. Dis. 20, e28–e37 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

El-Kamary, SS et al. Adjuvantierter intranasaler Norwalk-Virus-ähnlicher Partikelimpfstoff löst Antikörper und Antikörper-sekretierende Zellen aus, die Homing-Rezeptoren für Schleimhaut- und periphere Lymphgewebe exprimieren. J. Infizieren. Dis. 202, 1649–1658 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Atmar, RL et al. Norovirus-Impfstoff gegen experimentelle menschliche Norwalk-Virus-Erkrankung. N. engl. J. Med. 365, 2178–2187 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Westfall, J. et al. Thermische Stabilität und Epitopintegrität eines lyophilisierten Ricin-Toxin-Untereinheit-Impfstoffs. Vaccine 36, 5967–5976 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Autumn Smiley, M. et al. Vergleichende Immunogenität und Wirksamkeit der thermostabilen (lyophilisierten) und flüssigen Formulierung des Anthrax-Impfstoffkandidaten AV7909. Vaccine 37, 6356–6361 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zipursky, S. et al. Vorteile der Verwendung von Impfstoffen außerhalb der Kühlkette: Bereitstellung des Meningitis-A-Impfstoffs in einer kontrollierten Temperaturkette während der Massenimpfkampagne in Benin. Vaccine 32, 1431–1435 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lydon, P. et al. Wirtschaftliche Vorteile der Lagerung von Impfstoffen bei Umgebungstemperatur während Massenimpfungen: der Fall der Meningitis-A-Impfung im Tschad. Stier. Weltgesundheitsorgan. 92, 86–92 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Penn-Nicholson, A. et al. Sicherheit und Immunogenität des neuartigen Tuberkulose-Impfstoffs ID93 + GLA-SE bei BCG-geimpften gesunden Erwachsenen in Südafrika: eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Phase-1-Studie. Lanzettenatmung. Med. 6, 287–298 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Coler, RN et al. Das TLR-4-Agonist-Adjuvans GLA-SE verbessert das Ausmaß und die Qualität der durch den Tuberkulose-Impfstoff ID93 hervorgerufenen Immunantworten: erste Studie am Menschen. npj Vaccines 3, 34 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyadova, IV & Panteleev, AV Th1- und Th17-Zellen bei Tuberkulose: Schutz, Pathologie und Biomarker. Mediatoren Entzündung. 2015, 854507 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rijnink, WF, Ottenhoff, THM & Joosten, SA B-Zellen und Antikörper als Mitwirkende an Effektorimmunreaktionen bei Tuberkulose. Vorderseite. Immunol. 12, 640168 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons, JD et al. Immunologische Mechanismen der menschlichen Resistenz gegen eine persistierende Infektion mit Mycobacterium tuberculosis. Nat. Rev. Immunol. 18, 575–589 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyashchenko, KP, Vordermeier, HM & Waters, WR Gedächtnis-B-Zellen und Tuberkulose. Tierarzt. Immunol. Immunopathol. 221, 110016 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bertholet, S. et al. Ein definierter Tuberkulose-Impfstoffkandidat steigert BCG und schützt vor multiresistenten Mycobacterium tuberculosis. Wissenschaft. Übers. Med. 2, 53ra74 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoft, DF et al. PO- und ID-BCG-Impfungen induzieren beim Menschen unterschiedliche mukosale und systemische Immunantworten sowie transkriptomale molekulare Signaturen von CD4+-T-Zellen. Schleimhautimmunol. 11, 486–495 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoft, DF et al. Sicherheit und Immunogenität des rekombinanten BCG-Impfstoffs AERAS-422 bei gesunden BCG-naiven Erwachsenen: eine randomisierte, aktiv kontrollierte, erste Phase-1-Studie am Menschen. EBioMedicine 7, 278–286 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak, G. et al. Mischungsmodelle für Einzelzelltests mit Anwendungen für Impfstoffstudien. Biostatistik 15, 87–101 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Safety Monitoring Committee (W. Henry Boom, Fiona Smaill und Kathleen M. Neuzil), den Independent Safety Monitors (John Richart und Marie Philipneri) und dem Medical Monitor (Stuart Kahn) für ihre hervorragende Aufsicht und ihr Feedback. Die Autoren möchten auch unseren Kollegen aus der Abteilung für Mikrobiologie und Infektionskrankheiten/NIAID/National Institutes of Health (NIH) für hilfreiche und engagierte Diskussionen und Projektmanagement danken, darunter Larry Wolfraim, Carol Ostrye, Onyinye Erondu, Mohamed M. Elsafy, Mamodikoe Makhene, Jonathan McInnis, Michelle Wildman und Kamal Velmurugan. Die Autoren danken außerdem Prerana Ranjitkar, Elyse Beebe, Sandra Sivananthan, Elise Larson, Jannabeth Bannister und Tre Argerious für das Projektmanagement und die administrative Unterstützung; und redaktionelle Unterstützung von Valerie Soza. Diese Arbeit wurde durch Bundesmittel von NIAID, NIH, Department of Health and Human Services, im Rahmen des Vertrags Nr. HHSN272201400041C (CBF) unterstützt. NIAID war am Studiendesign, der Analyse und dem Verfassen von Manuskripten beteiligt.

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Joe Jiang und Lisa Ondrejcek

Abteilung für globale Gesundheit, University of Washington, Seattle, WA, USA

Corey Casper und Christopher B. Fox

Medizinische Fakultät, University of Washington, Seattle, WA, USA

Corey Casper

Abteilung für Impfstoffe und Infektionskrankheiten, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA

Corey Casper

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AMB, BF, CBF, CC, DFH, TD und ZKS haben die Studie konzipiert. AL, AMB, CBF, DFH, FL, JT, LO und SJ überwachten die Forschung. AL, AMB, CBF, DFH, FL, JT und SJ verwalteten das Projekt. AMB, AB, DFH und RM stellten Ressourcen zur Verfügung. CBF hat Fördermittel eingeworben. AMB, AF, AB, CBF, CC, CG, DFH, IK, JT, JV, LT, RM, SJ und ZKS haben an der Untersuchung mitgewirkt. AMB, AB, BF, CBF, DFH, JV, RM, SJ, TD und ZKS haben zur Methodik beigetragen. AF, AB, CBF, CG, SJ und ZKS haben die Daten kuratiert. CBF, JJ und LO analysierten die Daten. CBF, JJ, LO und ZKS visualisierten die Daten. CBF und ZKS haben den ersten Entwurf des Manuskripts verfasst. AF, AB, BF, CBF, CC, CG, DFH, FL, IK, JJ, LT, SJ, TD und ZKS haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Christopher B. Fox.

CBF gibt keine konkurrierenden nichtfinanziellen Interessen an, sondern die folgenden konkurrierenden finanziellen Interessen. CBF ist Miterfinder von Patenten, die die Priorität von WO/2015/103167 (Einzelfläschchen-Impfstoffformulierungen) und WO/2013/119856 (verbesserte Adjuvansformulierungen mit TLR4-Agonisten und Methoden zu deren Verwendung) beanspruchen. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sagawa, ZK, Goman, C., Frevol, A. et al. Sicherheit und Immunogenität eines thermostabilen ID93 + GLA-SE-Tuberkulose-Impfstoffkandidaten bei gesunden Erwachsenen. Nat Commun 14, 1138 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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Eingegangen: 23. Dezember 2022

Angenommen: 16. Februar 2023

Veröffentlicht: 06. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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