Alternative Boronsäuren beim Nachweis von Mycolacton A/B mittels Dünnschichtchromatographie (z

BMC Infectious Diseases Band 23, Artikelnummer: 495 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycobacterium ulcerans ist der Erreger des Buruli-Ulkus. Die Pathologie der M. ulcerans-Krankheit wird auf die Sekretion eines starken Makrolid-Zytotoxins namens Mycolacton zurückgeführt, das eine wichtige Rolle bei der Virulenz der Krankheit spielt. Mycolacton ist ein Biomarker für die Diagnose von BU, der mit der Fluoreszenz-Dünnschichtchromatographie (f-TLC) nachgewiesen werden kann. Die Technik beruht auf der chemischen Derivatisierung von Mycolacton A/B mit 2-Naphthylboronsäure (BA), die als fluorogener Chemosensor fungiert. Hintergrundinterferenzen aufgrund koextrahierter menschlicher Gewebelipide, insbesondere bei klinischen Proben, gepaart mit der Subjektivität der Methode erfordern jedoch eine Untersuchung, um eine Alternative zu BA zu finden.

26 im Handel erhältliche Arylboronsäuren wurden zunächst mithilfe des f-TLC-Experiments als Alternativen zu BA untersucht. Es wurden auch UV-Vis-Messungen durchgeführt, um die Absorptionsmaximumspektren von Mycolacton A/B und Mycoboronsäureaddukten zu bestimmen, gefolgt von einer Untersuchung der fluoreszenzverstärkenden Fähigkeit der Boronatesterbildung zwischen Mycolacton A/B und unseren drei vielversprechendsten Borsäureaddukten Säuren (BA15, BA18 und BA21). Zur Bestätigung der Adduktbildung zwischen Mycolacton und Boronsäuren wurde die LC-MS-Technik eingesetzt. Darüber hinaus wurde eine Vergleichsstudie zwischen BA18 und BA unter Verwendung von 6 durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bestätigten BU-Patientenproben durchgeführt.

Drei der Boronsäuren (BA15, BA18 und BA21) erzeugten Fluoreszenzbandenintensitäten, die denen von BA überlegen waren. Komplexierungsstudien, die mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung einer 0,1 M Lösung der drei Boronsäuren und verschiedener Volumina von 10 ng/µL synthetischem Mycolacton im Bereich von 1 µL – 9 µL entsprechend 10 ng – 90 ng durchgeführt wurden, ergaben ähnliche Ergebnisse mit Myko- BA18-Addukt entsteht mit den sichtbarsten Fluoreszenzbanden. UV-Vis-Absorptionsmaxima (λmax) für das freie Mycolacton A/B wurden bei 362 nm beobachtet, und die Werte für die Addukte Myco-BA15, Myco-BA18 und Myco-BA21 lagen bei 272 nm, 270 nm und 286 nm jeweils. Der vergleichbare experimentelle λmax von 362 nm für Mycolacton A/B mit dem berechneten Woodward-Fieser-Wert von 367 nm für die Fettsäureseitenkette von Mycolacton A/B zeigt, dass, obwohl zwei zyklische Boronate gebildet wurden, nur das Boronat der Südseite gebildet wurde Die Kette mit dem Chromophor wurde durch Bestrahlung bei 365 nm angeregt. Fluoreszenzexperimente haben gezeigt, dass die Kopplung von BA18 an Mycolacton A/B entlang der 1,3-Diole die Fluoreszenzintensität bei 537 nm deutlich steigerte. Zur Bestätigung der Bildung des Myco-BA15-Addukts wurde ein hochauflösendes Massenspektrometer (HR-MS) verwendet. Schließlich ergab die f-TLC-Analyse von Patientenproben mit BA18 verbesserte Intensitäten des BA18-Addukts im Vergleich zum ursprünglichen BA-Addukt.

26 im Handel erhältliche Boronsäuren wurden als Alternativen zu BA untersucht und in der f-TLC-Analyse zur Diagnose von BU verwendet. Drei (3) davon, BA15, BA18 und BA21, ergaben überlegene Intensitätsprofile der Fluoreszenzbanden. Sie ergaben Profile, die nach der Bildung des Mykoboronsäureaddukts leichter zu interpretieren waren und in Experimenten mit klinischen Proben von Patienten mit BA18 die besten waren. BA18 wurde daher als potenzielle Alternative zu BA identifiziert und könnte eine Lösung für das Problem der Hintergrundinterferenz von koextrahierten menschlichen Gewebelipiden aus klinischen Proben bieten, die derzeit mit der Verwendung von BA verbunden sind.

Peer-Review-Berichte

Mycolacton (ML), das erste Makrolid-Zytotoxin, von dem bekannt ist, dass es von einem humanpathogenen Mycobacterium ulcerans (MU) produziert wird, ist der Erreger des Buruli-Ulkus (BU) [1, 2]. Es ist das einzige Makrolid, das in der Gattung Mycobacterium identifiziert wurde [3]. Im Jahr 1965 stellten Connor und Mitarbeiter die Hypothese auf, dass M. ulcerans für die Produktion des diffundierbaren Zytotoxins verantwortlich sei, was später an Meerschweinchen bestätigt wurde. Die Injektion von Filtraten der Mykobakterienkultur in das Versuchstier führte zu einer Nekrose, wie sie bei Infektionen beim Menschen auftritt [4,5,6]. Das vermutete Molekül wurde später 1999 von George et al. effektiv aus dem acetonlöslichen Teil der Lipidextrakte von M. ulcerans isoliert, gereinigt und charakterisiert. Die chemische Struktur wurde anschließend als Polyketid namens Mycolacton (ML) gelöst [7, 8]. ML wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) als hellgelbe, ultraviolettaktive Lipidbande mit einem Retentionsfaktorwert von 0,23 in Chloroform/Methanol/Wasser (90:10:1, Vol./Vol./Vol.) nachgewiesen [7]. Ein markanter Peak bei m/z 765, der dem Natriumaddukt von Mycolacton entspricht, wurde durch massenspektrometrische (MS) Analyse unter Elektrospray-Bedingungen beobachtet. ML ist ein hybrides Polyketid-Makrolid mit einem 12-gliedrigen Lactonring im Kern, zusammen mit einer C5-O-verknüpften mehrfach ungesättigten Acylseitenkette mit der Nummer C1′-C16′ im Süden und einer C-verknüpften oberen Seitenkette, bestehend aus Kohlenstoffatome C12–C20. Unterschiedliche Kongenere von Mycolacton resultieren aus Unterschieden in der „südlichen“ Kette, während die obere „nördliche“ Kette unveränderlich ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass das aus M. ulcerans gewonnene Mycolacton eine 3:2-Kombination der beiden als Mycolactone A und B bekannten Stereoisomere war, die sich als spontane geometrische Isomere um die Doppelbindung an C4′ C5′ bilden (dargestellt durch die Wellenlinie dazwischen). C5′ und C6′) [9, 10] (Abb. 1).

Struktur von Mycolacton A/B. Mycolacton A/B hat einen zyklischen Lacton-Kernring (C1-C11) und zwei hochungesättigte Acylseitenketten, die aus Polyketiden hergestellt werden. Die längere „südliche“ Kette ist mit C1′-C16′ nummeriert und die obere „nördliche“ Kette besteht aus C12-C20. Mycolacton liegt im Verhältnis 3:2 spontan entstehender geometrischer Isomere um die Doppelbindung an C4′ und C5′ vor (dargestellt durch die Wellenlinie zwischen C5′ und C6′).

Die Pathologie der M. ulcerans-Krankheit wurde größtenteils auf die Sekretion dieses starken Zytotoxins zurückgeführt, einer Substanz, die für die Pathogenität der Krankheit von entscheidender Bedeutung ist [7]. In verschiedenen Berichten wurden dem Toxin Gewebenekrose, Schmerzlosigkeit und immunsuppressive Eigenschaften zugeschrieben [11, 12]. Mycolacton A/B diffundiert außerhalb der ursprünglichen Infektionsherde und ist daher ein interessantes Ziel für den Nachweis in zirkulierenden Blutzellen [13].

Da das Toxin nur von M. ulcerans produziert wird, wird Mycolacton als Biomarker für die Diagnose der Buruli-Ulkus-Krankheit untersucht. Methoden wie Dünnschichtchromatographie (TLC) [7, 8], Massenspektrometrie [14, 15, 16] oder Zytotoxizitätstests [15] wurden entwickelt, um Mycolacton in Gewebeproben nachzuweisen und zu quantifizieren und so die Diagnose der BU-Erkrankung zu ermöglichen. Mycolacton wurde kürzlich in Patientenbiopsieproben mittels LC-MS [15, 17] und RNA-Aptamer-Bindung [18] untersucht.

Für Diagnosezwecke wurde von Kishi und Kollegen eine sehr empfindliche, praktische und relativ wirtschaftliche und einfach anzuwendende Methode der Fluoreszenz-Dünnschichtchromatographie (f-TLC) zum Nachweis der vom menschlichen Krankheitserreger Mycobacterium ulcerans produzierten Mykolaktone entwickelt [19]. ]. Bei der Methode wurde Mycolacton A/B unter Verwendung von 2-Naphthylboronsäure (BA) als fluorogenem Chemosensor chemisch derivatisiert (Abb. 2). Die 1,3-Diol-Einheiten an den Seitenketten von Mycolacton A/B komplexieren mit der Boronsäure, um zwei 6-gliedrige cyclische Boronatringe zu erzeugen. Wenn das Pentanoat-Chromophor an der südlichen Seitenkette mit einer Wellenlänge von 365 nm bestrahlt wurde, wurde die verstärkte Fluoreszenzemission des C13', C15'-zyklischen Boronats bei der Chromophor-Emissionswellenlänge von 520 nm beobachtet [19] (Abb. 2).

Schematische Darstellung der Fluoreszenz-TLC-Nachweismethode, die die Derivatisierung von Mycolacton A/B mit BA zeigt [19]

Boronsäuren wurden zuvor mit cis-1,2- und 1,3-Diolen gekoppelt, um reversible fünf- oder sechsgliedrige cyclische Boronatester zu erzeugen [20,21,22,23]. Die Fluoreszenz kann durch die Bildung von Boronsäureestern stark beeinflusst werden. Der erste Bericht über die Verwendung von Boronsäure als Rezeptor für die Sacchariderkennung wurde 1992 von Yoon und Czarnik erstellt [24]. Seitdem nutzen zahlreiche biomedizinische Anwendungen die ausgeprägten Erkennungseigenschaften von Boronsäuren und Boronsäureanaloga gegenüber 1,2- oder 1,3-Diolen [25]. Im Bereich der diagnostischen Medizin spielen Sensoren eine entscheidende Rolle, da sie eine schnelle und quantitative Auflösung von Analyten ermöglichen. Whyte und Mitarbeiter zeigten, dass Boronsäuren zuverlässige Sensoren für eine Vielzahl von Sacchariden, Polysacchariden, Glykoproteinen, glykierten Proteinen und Dopamin sind [25].

Darüber hinaus wurden Boronsäuresensoren entwickelt, um den Blutzuckerspiegel [26,27,28,29,30], ionische Verbindungen [31,32,33], Wasserspuren in Lösungsmitteln [34, 35] und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu messen. [36, 37] und Katecholamine [38]. Boronsäuren wurden auch als biochemische Werkzeuge für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter die Bildgebung von Tumorzellen [39, 40], Enzyminhibitoren [41] und Zellabgabemethoden [42]. Aus diesen Gründen sind borbasierte Fluoreszenzsensoren in der aktuellen Forschung von entscheidender Bedeutung.

Der Nachweis von Mycolacton durch Kopplung an BA wurde erfolgreich nachgewiesen [19, 43,44,45]. Allerdings müssen Bedenken wie Hintergrundstörungen durch mitextrahierte menschliche Gewebelipide berücksichtigt werden. Die Suche nach einer effizienteren und fluoreszierenderen Boronsäure als Alternative zur ursprünglichen BA, die von Kishi und Mitarbeitern verwendet wurde, ist erforderlich. Um mögliche Alternativen zu BA zu finden, wurden mehrere kommerziell erhältliche Arylboronsäuren mittels f-TLC gescreent. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) der gekauften Boronsäuren wurde durchgeführt und das Profil ihrer Fluoreszenzbandenintensitäten mit BA verglichen.

Synthetisches Mycolacton A/B wurde freundlicherweise von Prof. Kishi Yoshito (Harvard University) über die Weltgesundheitsorganisation (WHO), Genf, Schweiz, gespendet. Alle 26 strukturell unterschiedlichen Arylboronsäuren wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Alle Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Die Lösungsmittel sind handelsüblich und wurden wie geliefert verwendet. Fluoreszenzfarbstofffreie TLC-Kieselgel-60-Platten (5721–7) wurden von EMD Chemical Inc. gekauft und für die Entwicklung der Platte in 5 × 2 cm große Größen geschnitten. Bei der verwendeten UV-Lampe handelte es sich um einen Tisch-UV-Transilluminator (UV-Lampe 365/302 nm (8 Watt) der UVLM-28 EL-Serie, erworben von UVP Inc.).

Lösungen von 0,1 M der verschiedenen strukturell unterschiedlichen Arylboronsäuren wurden durch Zugabe von Aceton hergestellt und gemäß dem vorherigen Bericht von Kishi und Mitarbeitern verwendet [19]. Eine Standard-Mycolacton-A/B-Lösung für das DC-Spotting wurde aus einer Stammlösung von 0,1 mg/ml Mycolacton in 0,5 ml in einer Ampulle hergestellt. Eine 10 ng/μL-Standardlösung von Mycolacton A/B wurde hergestellt, indem 0,1 ml der Mycolacton-Stammlösung in ein Glasfläschchen gegeben und 0,9 ml Ethylacetat hinzugefügt wurden, um den erforderlichen Standard zu erhalten. Eine optimale Visualisierung von Mycolacton A/B wurde erreicht, indem der Standard auf die mit Siliciumdioxid beschichteten Glas-TLC-Platten getupft wurde, mit einer Mischung aus Chloroform/Hexan/Methanol (5:4:1; v/v/v) eluiert wurde und schließlich langsam Eintauchen der eluierten Platte in die 0,1 M Boronsäurelösungen, Entfernen und anschließendes Erhitzen der Platte auf eine Temperatur von ~ 100 °C. Die Glasseite der Platte wurde dann mit einem mit Aceton getränkten Papiertuch abgewischt und anschließend durch Beleuchtung bei ~ 365 nm mit einem Tisch-UV-Transilluminator betrachtet.

Die Absorptionsspektren wurden mit einem Shimadzu UV-1800 Spektrophotometer aufgezeichnet. Alle UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit Quarzküvetten mit einem Durchmesser von 1 cm zwischen 200 und 800 nm aufgenommen.

Fluorometrische Experimente wurden sowohl mit einem Shimadzu-Spektrofluorometer (Modell RF-6000) als auch mit einem Horiba Jobin Yvon (HJY) Fluoromax-3-Spektrofluorometer durchgeführt. Emissionsspektren wurden bei Raumtemperatur mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Spaltbreiten der Anregung und Emission auf 5 nm bzw. 10 nm aufgenommen. Verschiedene Verdünnungen von Mycolacton A/B (4 bis 32 µg/ml) wurden aus einer Standardlösung von Mycolacton A/B (0,1 mg/ml in 0,5 ml EtOAc) hergestellt, wie in Tabelle 1 unten gezeigt, in bernsteinfarbenen 4-ml-Fläschchen. Sie wurden mit Cyclohexan verdünnt, um die Endkonzentrationen zu erhalten.

Lösungen der Boronsäuren 2-Naphthylboronsäure (BA), [1,1':4',1''-Terphenyl]-2-ylboronsäure (BA15), (9,9-Diphenyl-9H-fluoren-4-yl). )Boronsäure (BA18) und (3-(Naphthalin-1-yl)phenyl)boronsäure (BA21) (0,10 M) in Methanol wurden ebenfalls hergestellt. Um 1-ml-Reaktionen durchzuführen, wurden sieben Proben mit 500 μl 0,10 M BA18-Lösung und 500 μl jeder Verdünnung der Mycolacton A/B-Standardlösung (4 bis 32 μg/ml) in Tabelle 1 in 1,5-ml-Mikroröhrchen verteilt und gut gemischt und die Fluoreszenzspektren wurden nach 10 Minuten aufgezeichnet (λex 365 nm und λem von 380 bis 700 nm).

Zu einer Lösung von Diol (1 Äquiv.) in Dichlormethan (DCM) (1 M) wurde die Boronsäure (1 Äquiv.) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der resultierende Rückstand 1 Stunde lang im Hochvakuum (0,1 mm Hg) getrocknet. Anschließend wurde es in Cyclohexan erneut gelöst und als Stammlösung für die massenspektrometrische Analyse verwendet (Abb. 3).

Reaktion von 1,3-Diol mit Arylboronsäure zur Bildung eines 6-gliedrigen cyclischen Boronatesters

Die Analysen wurden mit einem 1260 Infinity LC (Agilent Technologies) durchgeführt, der über eine Jet Stream ESI-Schnittstelle (Agilent Technologies) mit einem Quadrupol-Time of Flight-Tandem-Massenspektrometer 6530 Infinity Q-ToF-Detektor (Agilent Technologies) gekoppelt war. Die LC-Bedingungen waren: Zorbax Extend-C18-Säule (2,1 mm ⨯ 50 mm, 1,8 μm Partikelgröße); 0,4 ml/min Durchflussrate; 1 μL Injektionsvolumen für MS-Experimente. und 10 μL für MSMS-Experimente; 40 °C Säulentemperatur. Die Trennung wurde mithilfe eines Gradienten aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (Eluent A) und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (Eluent B) erreicht. Der Elutionsgradient wurde wie folgt programmiert: Anfangsbedingungen 5 % B, gefolgt von einem linearen Gradienten bis 95 % B in 15 Minuten. Die ESI-Betriebsbedingungen waren Trocknungsgas (N2, Reinheit > 98 %): 350 °C und 11 L/min; Kapillarspannung 4,0 kV; Zerstäubergas 40 psig; Hüllgas (N2, Reinheit > 98 %): 375 °C und 11 L/min. Hochauflösende MS-Spektren wurden im Positivmodus im Bereich von 100–2400 m/z aufgenommen.

Klinische Proben, bei denen durch Goldstandard-Polymerasekettenreaktion (PCR) bestätigt wurde, dass IS2404 entweder BU oder Nicht-BU ist, wurden mit der f-TLC-Methode unter Verwendung der ursprünglichen Boronsäure BA bzw. der vielversprechendsten Boronsäure, BA18, analysiert. Es wurden sowohl Feinnadelaspirate (FNA) als auch Abstrichproben analysiert. Standard-PCR-Targeting IS2404 wurde gemäß dem von Stinear et al. beschriebenen Protokoll durchgeführt. [46].

Die Extraktion und Detektion von Mycolacton mittels Fluoreszenz-Dünnschichtchromatographie (f-TLC) erfolgte gemäß dem an anderer Stelle veröffentlichten Protokoll [43]. Das die gelöste Probe enthaltende Ethanol wurde durch einen Wattestopfen in ein Glasfläschchen filtriert. Der Probenbehälter wurde weiter mit 1 ml Ethylacetat gespült, das durch einen Wattestopfen in das Glasfläschchen gegeben wurde, und der Inhalt wurde unter reduziertem Druck von etwa 10–15 mmHg mit einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft. Um kontaminierende Feststoffe von der Flüssigkeit zu trennen, wurden 100 μl Hexan/Ether (1:1)-Lösung in das Glasfläschchen gegeben, gespült und mit einer Mikrospritze in ein sauberes Glasfläschchen überführt, das an der Luft getrocknet wurde. Nach dem Verdampfen wurden der trockenen Probe 50 μl Hexan/Ether (1:1) zugesetzt und 10 μl der resuspendierten Probe auf eine 3,3 × 6,6 cm große fluoreszenzfarbstofffreie TLC-Platte (TLC Silica Gel 60, EMD Millipore, Darmstadt) getüpfelt , Deutschland; Gibbstown, NJ, USA) neben 50 ng synthetischem Mycolacton A/B-Standard in Ethylacetat und einem Co-Spot von 10 μL Probe mit 50 ng synthetischem Mycolacton A/B. Die Platte wurde in Chloroform/Hexan/Methanol (5:4:1; v/v/v) entwickelt, bis die Vorderkante die Oberseite der Platte erreichte, luftgetrocknet und in eine 0,1 M Lösung von BA und (9) getaucht ,9-Diphenyl-9H-fluoren-4-yl)boronsäure (BA18) in Aceton, dann 60 s lang auf einer Heizplatte auf 100 °C erhitzt. Die Glasseite der Platte wurde mit Aceton auf einem Papiertuch abgewischt. Die Platte wurde auf eine UV-Lampe mit einem 365-nm-Filter gelegt. Die Fluoreszenzbande bei einem Retentionsfaktor von 0,23 aus der Patientenprobe wurde mit der der Standards verglichen, um das Vorhandensein von Mycolacton zu bestätigen. Die f-TLC-Platten wurden von zwei Laboranalytikern unabhängig voneinander gelesen, bevor die Ergebnisse gemeldet wurden. Die Laboranalytiker, die sowohl an den f-TLC- als auch an den PCR-Proben arbeiteten, waren für bestimmte relevante klinische Informationen (mit Ausnahme von Alter und Geschlecht) sowie für die diagnostischen Testergebnisse der jeweils anderen Mitarbeiter blind. Dadurch sollte sichergestellt werden, dass es zu keiner Diagnoseverzerrung kommt [43].

Die TLC-Profile von 26 im Handel erhältlichen Arylboronsäuren (Zusatzdokument 1, Tabelle S1) wurden erhalten und ihre Fluoreszenzbandenintensitätsprofile mit BA verglichen. Ein visueller Vergleich der Fluoreszenzbanden auf allen TLC-Profilen zeigt, dass drei der Boronsäuren (BA15, BA18 und BA21) BA visuell überlegen waren. Sie ergaben im Vergleich zu BA ausgezeichnete und hochintensive gelbe Fluoreszenzbanden auf einem blauen Hintergrund der TLC-Platte unter 365-nm-UV-Licht (Tabelle 2). Aufgrund dieser vielversprechenden Ergebnisse wurden die drei für weitere quantitative und spektroskopische Studien ausgewählt.

Aus der vorbereiteten Arbeitskonzentration von 10 ng/µL synthetischem Mycolacton wurden verschiedene Volumina im Bereich von 1 µL – 9 µL, was 10 ng – 90 ng entspricht, mit 1–5 µL kalibrierten Mikropipetten (Drummond Scientific) auf die TLC-Platte aufgetragen. Wie bei der obigen Beobachtung ergaben die drei Boronsäuren im Vergleich zu BA bei allen Konzentrationen intensivere Fluoreszenzbanden. Von den drei neuen erzeugte BA18 die sichtbarsten Fluoreszenzbanden (Abb. 4).

Repräsentative DC-Profile nach dreifachen Experimenten für jede Boronsäure (BA, BA15, BA18 und BA21). Vergleich der ursprünglichen Boronsäure (BA) mit den drei vielversprechendsten Boronsäuren (BA15, BA18 und BA21) für den Nachweis von synthetischem Mycolacton A/B. Verschiedene Volumina (1 – 9 µL) der Arbeitslösung von Mycolacton A/B (10 ng/ml) wurden auf eine Kieselgel-Dünnschichtchromatographieplatte getupft und in eine 0,1 M Lösung von Boronsäuren (BA, BA15, BA18 und) getaucht BA21), eluiert mit Chloroform/Hexan/Methanol (5:4:1; v/v/v), auf 100 °C erhitzt und bei 365 nm mit einem Tisch-UV-Transilluminator (UV-Lampe 365/365 der EL-Serie UVLM-28) beleuchtet. 302 nm (8 Watt)

Als nächstes führten wir UV-Vis-Messungen durch, um die Absorptionsmaximumspektren von Mycolacton A/B und Myco-Boronsäure-Addukten zu bestimmen. Die UV-Vis-Spektren des freien Mycolactons A/B und seiner Boronsäureaddukte sind in Abb. 5 dargestellt. Die Absorptionsmaxima (λmax) des freien Mycolactons A/B betrugen 362 nm, während die Werte bei 272 nm, 270 nm und lagen Für Myco-BA15, Myco-BA18 und Myco-BA21 wurden jeweils 286 nm erhalten.

Absorptionsspektren von Mycolacton A/B und Mycoboronsäurekomplexen. A (a) Mycolacton A/B in MeOH (λmax 362 nm); (b) Mycolacton A/B – BA15-Boronat-Komplex in MeOH ((λmax 272 nm); (c) Mycolacton A/B – BA18-Boronat-Komplex in MeOH ((λmax 270 nm); (d) Mycolacton A/B – BA21-Boronat Komplex in MeOH (λmax 286 nm). B Absorptionsspektren (a) Mycolacton A/B in MeOH (λmax 362 nm); (b) Mycolacton A/B – BA18-Boronat-Komplex in MeOH ((λmax 270 nm)

In einem anderen Experiment untersuchten wir die fluoreszenzverstärkende Fähigkeit der Boronatesterbildung zwischen Mycolacton A/B und unseren drei vielversprechendsten Boronsäuren (BA15, BA18 und BA21) (Abb. 6A). Wenn Mycolacton A/B in Cyclohexan bei 365 nm angeregt wurde, ergab das Pentaenoat eine Fluoreszenzemission bei 537 nm. Nach der Kopplung von BA18 an das 1,3-Diol wurde die Fluoreszenzintensität bei derselben Wellenlänge deutlich erhöht (Abb. 6B). Es wurde auch beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität zunahm, wenn die Mycolactonkonzentration von 0 auf 20 µg/ml anstieg, Abb. 6C. Als die Fluoreszenzintensität bei 537 nm gegen die Mycolactonkonzentration aufgetragen wurde, wurde eine lineare Kalibrierungskurve mit einem Regressionskoeffizienten von 0,93 erhalten (Abb. 6D).

Fluoreszenzemissionsspektren in Cyclohexan, aufgenommen bei Raumtemperatur mit dem Fluoromax-3-Spektrofluorimeter von Horiba Jobin Yvon (HJY). Anregungswellenlänge 365 nm (Anregungsspaltbreite 5 nm, Emissionsspaltbreite 10 nm). A (a) Mycolacton A/B-BA-Boronat-Komplex; (b) Mycolacton A/B-BA15-Boronat-Komplex; (c) Mycolacton A/B-BA18-Boronat-Komplex; (d) Mycolacton A/B-BA21-Boronat-Komplex; (λmax 534 nm); B Fluoreszenzemissionsspektren (a) BA18; (b) Mycolacton A/B in Cyclohexan (λmax 537 nm); (c) Mycolacton A/B-BA18-Boronat-Komplex ((λmax 270 nm); C (a) Lösungsmittel (Cyclohexan); (b) freies BA18 (0,10 mol dm−3); (c) freies Mycolacton (32 µg/ml). ); (d–h) Mycolacton A/B-Boronsäure 18-Komplexe, die BA18-Konzentration wurde in den Gemischen auf 0,10 mol dm−3 festgelegt, während die Mycolacton-Konzentrationen 4 µg/ml, 8 µg/ml, 12 µg/ml betrugen. 16 µg/ml bzw. 20 µg/ml in den Mischungen; DA-Diagramm der Fluoreszenzintensität bei 537 nm gegen verschiedene Konzentrationen von Mycolacton A/B

Um die Korrelation zwischen Anregungs- und Emissionsspektralverschiebungen zu untersuchen, zeichnen wir den Anregungspeak gegenüber dem entsprechenden Emissionspeak für den Myco-BA18-Boronatkomplex in Cyclohexan bzw. Methanol auf (Abb. 7A). Aus der Darstellung konnten wir ein Emissionspeakmaximum bei einer höheren Wellenlänge (λexmax 537 nm) im Vergleich zum Anregungspeakmaximum (λemmax 362 nm) beobachten. Anschließend haben wir die Stokes-Verschiebung für den Myco-BA18-Boronatkomplex gegenüber den Peakmaxima des Anregungs- und Emissionsspektrals auf 175 nm bestimmt. Eine signifikante Fluoreszenzverstärkung wurde visuell im TLC bei 537 nM mit (blau) Boronsäure im Vergleich zu ohne (rot) unter Verwendung einer 365 nM UV-Lampe beobachtet (Abb. 7B).

A Emissionsspektren (λmax 537 nm) und entsprechende Anregungsspektren (λmax 362 nm), erhalten für den Myco-BA18-Boronatkomplex in Cyclohexan bzw. Methanol; B Myco-BA18-Boronat-Komplex unter 365 nm UV

Eine hochauflösende massenspektroskopische (MS) Analyse wurde durchgeführt, um die Bildung des Mycolacton-BA15-Addukts zu bestätigen. Zunächst wurde eine MS-Analyse von Mycolacton A/B durchgeführt und das erhaltene Chromatogramm ist in (Abbildung S1) dargestellt. Der Molekülionenpeak wurde bei m/z 765,4760 mit der Formel C44H70O9Na erhalten, was dem Natriumaddukt von Mycolacton A/B entspricht. Dies steht im Einklang mit der zuvor in der Literatur veröffentlichten Masse für das Toxin [7]. Dann wurde eine chemische Reaktion gemäß Abb. 8 zwischen Mycolacton A/B und B15 durchgeführt, wonach die Massenspektrometeranalyse wiederholt wurde.

Vorgeschlagene Komplexierungsreaktion zwischen Boronat-1,3-Diolen von Mycolacton A/B und BA15 zur Bildung eines zyklischen Boronat-Addukts

Der Erfolg der Reaktion wurde durch HR-MS-Analyse bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Myco-BA15-Boronatester-Addukt gebildet wurde, wie in Abb. 9 unten und Zusatzdokument 1, Abbildung S2 gezeigt. Ein neues m/z-Signal, das bei 1241,6823 beobachtet wurde und [M + Na]+ entspricht, wird dem Myco- BA15-Natriumaddukt mit der Elementarformel C80H92B2O9Na, was die Bildung des erforderlichen Addukts bestätigt. Darüber hinaus bestätigten die MS-Daten deutlich die in UV-Vis- und Fluoreszenzexperimenten beobachteten Intensitätsänderungen.

Elektrospray-Ionisations-(ESI)-Massenspektrum des Mycolacton-A/B-BA15-Boronat-Addukts

Eine Vergleichsstudie zwischen der vielversprechenden Boronsäure (BA18) und der ursprünglichen Boronsäure (BA) unter Verwendung der f-TLC-Methode wurde an fünf (5) verschiedenen PCR-positiv bestätigten BU-Patienten durchgeführt. Es wurden zwei Messreihen durchgeführt (Abb. 10): Zuerst wurde das ursprüngliche BA (oberes Feld) zur Bildung der Addukte gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen verwendet, gefolgt von B18 (unteres Feld). Wie die mit nichtklinischen Proben erhaltenen Ergebnisse zeigte B18 im Vergleich zu BA eine verbesserte Intensität des Myko-B18-Adduktflecks. Darüber hinaus war es einfacher, die TLC-Profile der Proben mit Hintergrundstörungen zu interpretieren, die durch die eindeutigen Kennungen SA bzw. LN veranschaulicht werden. Außerdem wurden vier (4) verschiedene Nicht-BU-Proben der PCR-Negativkontrolle mit unserer vielversprechendsten BA18-Boronsäure analysiert, um einen Vergleich mit den positiven Fällen zu ermöglichen (Abb. 11). Hier ist es erwähnenswert, dass die TLC-Profile trotz der Hintergrundstörungen, die sich aus den mitextrahierten menschlichen Gewebelipiden aus den Proben ergeben, eindeutig negative Ergebnisse anzeigten, da BA18 im Vergleich zum ursprünglichen BA, wie im oberen Feld dargestellt, stark fluoresziert von Abb. 10.

f-TLC-Platten mit klinischen Proben aus 5 verschiedenen PCR-positiv bestätigten BU-Fällen. Jede TLC-Platte ist mit drei Spots markiert: Myco, S und CS für synthetisches Mycolacton A/B, Probe bzw. Co-Spot. Die Proben wurden in der gleichen Konzentration aufgetragen und die Platten wurden mit Chloroform/Hexan/Methanol (5:4:1; v/v/v) entwickelt.

f-TLC-Platten mit klinischen Proben aus 4 verschiedenen PCR-negativ bestätigten Nicht-BU-Fällen. Jede TLC-Platte ist mit drei Spots markiert: Myco, S und CS für synthetisches Mycolacton A/B, Probe bzw. Co-Spot. Die Proben wurden in der gleichen Konzentration aufgetragen und die Platten wurden mit Chloroform/Hexan/Methanol (5:4:1; v/v/v) entwickelt.

Vor der direkten Beobachtung unter 365-nm-UV-Licht wurden auf einer TLC-Oberfläche fluoreszierende Komplexierungsreaktionen verschiedener kommerziell erhältlicher Arylboronsäuren mit den 1,3-Diol-Einheiten auf der Mycolacton-A/B-Struktur durchgeführt. Mycolacton A/B ist in seiner freien Form schwach fluoreszierend; Allerdings wird es fluoreszierend, wenn es an eine geeignete Boronsäure gebunden wird. BA war die Boronsäure der Wahl für die f-TLC-Methode [19].

Die Woodward-Fieser-Regel wurde zur Korrelation elektronischer Übergänge und Strukturen von α,β-ungesättigten Ketonen sowie zur Vorhersage der Position der längstwelligen π → π*-Bande dieser Verbindungen eingesetzt [47, 48]. Hier haben wir die Woodward-Fieser-Regel verwendet, um eine vorhergesagte empirische Wellenlänge für den elektronischen Übergang π → π* mit der niedrigsten Energie von Mycolacton zu berechnen. Für α,β-ungesättigte Ester beträgt der Basiswert 215 nm. Insgesamt wurden 4 zusätzliche Doppelbindungen aus der Pentaenoatregion (jeweils + 30) und 3 methylsubstituierte Doppelbindungen mit jeweils + 18 hinzugefügt. Die Summe des berechneten Absorptionsmaximums betrug 367 nm im Vergleich zum experimentellen Wert von 362 nm, gemessen im UV. Dies steht im Einklang mit der UV-Vis-Analyse der Fettsäureseitenkette von Mycolacton A/B [44]. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl zwei zyklische Boronate gebildet werden, eines am Diol der südlichen Seitenkette und das andere an der nördlichen Seitenkette, nur das Boronat der südlichen Seitenkette mit dem Chromophor durch Bestrahlung durch einen 365-nm-Filter angeregt wurde. Das Boronat an der oberen Kette wurde jedoch nicht angeregt und trug daher nicht zur verstärkten Fluoreszenz unter UV-Licht bei [49]. Das gebildete Arylboronat hat das Potenzial, die Fluoreszenzemission zu verstärken [44, 45]. Dies liegt daran, dass die Anregung von Mycolacton allein eine schwache Fluoreszenz bei 537 nm mit einer Stokes-Verschiebung von 175 nm zeigte (Abb. 7A). Nachdem jedoch die Komplexierung mit der Boronsäure ausgelöst wurde, wurde eine signifikante Aktivierungsfluoreszenzverstärkung bei denselben 537 nm beobachtet, und die Fluoreszenz wurde auch visuell bei TLC unter Verwendung einer UV-Lampe beobachtet, wie in Abb. 7B gezeigt. Somit wird die Änderung der Fluoreszenzintensität von Mycolacton A/B auf einen Energietransfer vom angeregten Pentaenoat-Motiv, das als Fluorophor dient, auf einen fluorogenen Akzeptor in Form der Arylboronsäure (BA18) zurückgeführt [19].

26 im Handel erhältliche Arylboronsäuren wurden als mögliche Alternativen für BA untersucht. Es wurden TLC-Analysen der gekauften Boronsäuren durchgeführt und ihre Fluoreszenzbandenintensitätsprofile mit dem ursprünglichen BA verglichen. Die Boronsäuren bilden leicht Arylboronatester-Komplexe mit Mycolacton A/B und drei von ihnen ergaben überlegene Fluoreszenzbandenintensitäten. Eine Wiederholung der Komplexierung der Boronsäuren BA, BA15, BA18 und BA21 in seriell verdünntem BA von 10 ng/µL bis 90 ng/µL ergab ähnliche Ergebnisse, wobei BA18 als die sichtbarste Fluoreszenzbande hervortrat.

Bei der Durchführung von UV-Vis-Messungen mit Mycolacton A/B und Myco-Boronsäure-Addukten. Für Mycolacton A/B wurden Absorptionsmaxima (λmax) von 362 nm erhalten, während die von BA15, BA18 und BA21 272 nm, 270 nm bzw. 286 nm betrugen. Unter Anwendung der Woodward-Fieser-Regel wurde nur das Boronat der südlichen Seitenkette mit dem Chromophor durch Bestrahlung durch einen 365-nm-Filter angeregt, das der nördlichen Seite jedoch nicht.

Die Fluoreszenzintensität der Boronatesterbildung zwischen Mycolacton A/B und Boronsäuren nahm mit steigender Mycolactonkonzentration zu und die Bildung des Myco-BA15-Boronatesteraddukts wurde durch HR-MS bestätigt. Schließlich ergab eine Vergleichsstudie zwischen BA18 und BA unter Verwendung von PCR-bestätigten Patientenproben eine verbesserte Intensität des Addukts und einfacher zu interpretierende TLC-Profile der Proben, selbst für diejenigen mit Hintergrundstörungen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Fluoreszenz-Dünnschichtchromatographie

Dünnschichtchromatographie

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Referenzen herunterladen

Wir möchten dem Global Challenge Research Fund (GCRF) (RBV1, UG) für die Unterstützung der Arbeit danken. Die Autoren danken Professor Kishi Yoshito für die großzügige Spende von synthetischem Mycolacton A/B über die Weltgesundheitsorganisation für die Studie. Die Autoren danken auch Kabiru Mohammed Abass und seinem gesamten Team am Agogo Presbyterian Hospital in Ghana, wo die Patientenproben herkamen. Vor allem aber sind wir allen Patienten zu Dank verpflichtet.

Die Finanzierung der Studie erfolgte durch den Global Challenge Research Fund (GCRF) (164187, University of Sheffield, RBV1, UG).

Fachbereich Chemie, School of Physical and Mathematical Sciences, College of Basic and Applied Sciences, University of Ghana, Postfach LG 56, Legon, Accra, Ghana

Gideon A. Akolgo und Richard K. Amewu

Fachbereich Chemie, University of Sheffield, Dainton Building, Sheffield, S3 7HF, Großbritannien

Benjamin M. Partridge und Timothy D. Craggs

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GAA, BMP, TDC und RKA konzipierten die Projektidee. GAA., BMP, TDC und RKA haben das Projekt entworfen und GAA hat hauptsächlich Laborarbeiten durchgeführt, die Daten analysiert und interpretiert und den ursprünglichen Manuskriptentwurf erstellt. Alle Autoren haben wichtige Beiträge geleistet und die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Richard K. Amewu.

Diese Studie wurde am Department of Chemistry der University of Ghana durchgeführt. Klinische Proben wurden im Agogo Presbyterian Hospital, Ghana, als Teil des von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfohlenen Routinediagnoseverfahrens und der Fallbestätigung entnommen und zur f-TLC-Analyse an das DC geschickt. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board des Noguchi Memorial Institute of Medical Research (NMIMR) genehmigt (Studiennummer: NMIMR-IRB CPN 024/18–19). Darüber hinaus wurde die schriftliche Zustimmung aller erwachsenen Teilnehmer und Erziehungsberechtigten eingeholt, oder die Eltern eines minderjährigen Teilnehmers gaben im Namen des Kindes eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung ab. Um die Anonymität zu gewährleisten, wurden persönliche Informationen wie Namen und andere persönliche Identifikatoren im Zusammenhang mit Patientenproben durch Codes ersetzt.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Liste der versuchten Boronsäuren mit ihren entsprechenden TLCs. Abbildung S1. ESI-Massenspektrum von Mycolacton A/B. Abbildung S2. ESI-Massenspektrum des Mycolacton-A/B-BA15-Boronat-Addukts.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 28. Dezember 2022

Angenommen: 25. Juni 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-023-08426-2

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