Eine symbiotische physische Nische in Drosophila melanogaster reguliert die stabile Assoziation eines Multis
Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1557 (2023) Diesen Artikel zitieren
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Der Darm wird ständig von verschiedenen Bakterien aus der Nahrung und der Umwelt befallen, dennoch ist die Zusammensetzung des Mikrobioms für Wirtsarten von Säugetieren bis hin zu Insekten im Laufe der Zeit relativ stabil, was darauf hindeutet, dass wirtsspezifische Faktoren wichtige Bakterienarten selektiv aufrechterhalten können. Um die Wirtsspezifität zu untersuchen, verwendeten wir gnotobiotische Drosophila, mikrobielle Pulse-Chase-Protokolle und Mikroskopie, um die Stabilität verschiedener Bakterienstämme im Fliegendarm zu untersuchen. Wir zeigen, dass eine vom Wirt geschaffene physische Nische im Vorderdarm Bakterien selektiv mit Spezifität auf Stammebene bindet und so ihre Kolonisierung stabilisiert. Primäre Kolonisatoren sättigen die Nische und schließen sekundäre Kolonisatoren desselben Stamms aus, aber die anfängliche Kolonisierung durch Lactobacillus-Arten verändert die Nische physisch durch die Produktion eines glycanreichen Sekrets, um die sekundäre Kolonisierung durch nicht verwandte Kommensalen der Gattung Acetobacter zu begünstigen. Unsere Ergebnisse liefern einen mechanistischen Rahmen für das Verständnis der Etablierung und Stabilität eines Multi-Spezies-Darmmikrobioms.
Die Gesundheit des Wirts wird durch die Zusammensetzung des Darmmikrobioms beeinflusst, insbesondere durch die Arten und Stämme von Bakterien, die den Darm besiedeln1,2,3,4,5. Das Mikrobiom wird trotz täglicher Schwankungen in der Ernährung, dem Eindringen von Krankheitserregern6 und Störungen durch Antibiotika7 aufgebaut und aufrechterhalten. Viele Darmbakterien lokalisieren sich in bestimmten Regionen des Darms, die einer chemischen Umgebung entsprechen, die dem Stoffwechsel der jeweiligen Spezies entspricht8. Bestimmte Probiotika, insbesondere Lactobacillus-Arten, binden sich zusätzlich physisch an den Wirtsschleim und stabilisieren so deren Kolonisierung9,10. Da die Diversität auf Stammebene Hunderte bis Tausende beträgt11, bleibt es rätselhaft, wie ein Wirt eine bestimmte Gruppe von Stämmen auswählen und aufrechterhalten kann. Eine Hypothese besagt, dass die langfristige Aufrechterhaltung von Ernährungs- und Lebensgewohnheiten die Stabilität des Mikrobioms stärkt12,13,14,15,16, während eine andere, nicht ausschließliche Hypothese besagt, dass der Wirt physische Nischen im Darm baut, die spezifische symbiotische Bakterien aufnehmen und sequestrieren17, 18,19,20,21,22.
Das Mikrobiom der Fruchtfliege Drosophila melanogaster wird seit über einem Jahrhundert untersucht und ist in seiner Zusammensetzung im Vergleich zum Darmmikrobiom von Säugetieren relativ einfach23. Dennoch bleibt unklar, wie der Zusammenbau des Fliegendarm-Mikrobioms reguliert wird. Ähnlich wie die Dickdarmkrypten von Säugetieren ist der Fliegendarm mikroaerob und wird von Bakterien der Klasse Lactobacillales und Proteobacteria phylum besiedelt22,24,25,26. Fliegen können problemlos keimfrei aufgezogen und dann mit definierten Bakterienstämmen assoziiert werden, was ein hohes Maß an biologischer Kontrolle ermöglicht27. Darüber hinaus weist das Fliegendarm-Mikrobiom eine geringe Diversität auf, mit etwa 5 Arten stabiler Kolonisatoren aus zwei Hauptgruppen: den Gattungen Lactobacillus (Phylum Firmicutes), die kürzlich in Lactiplantibacillus und Levilactibacillus aufgeteilt wurden, und Acetobacter (Klasse α-Proteobacteria)26,28 . Diese Arten sind leicht zu kultivieren, genetisch kontrollierbar27 und sie beeinflussen die Lebensdauer, Fruchtbarkeit und Entwicklung von Fliegen29,30,31,32,33,34,35. Während seit langem argumentiert wird, dass die Besiedlung des Fliegendarms unspezifisch durch Filtermechanismen des Wirts, einschließlich Nahrungspräferenzen, Immunität und Verdauung, reguliert wird, deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Fliegen in freier Wildbahn auch selektiv Lactobacillus- und Acetobacter-Stämme erwerben können24,36 und diese kann Fliegen während der Larvenphase mit Nahrung versorgen37.
Hier entdecken wir eine physische Nische im Vorderdarm erwachsener Drosophila, die speziell von wilden Stämmen von Lactobacillus und Acetobacter besiedelt wird. Wir charakterisieren die räumliche Spezifität der Nische, die Bakterienstammspezifität für die Kolonisierung und die Stabilität der Kolonisierung. Wir messen vorrangige Effekte, die die Reihenfolge regulieren, in der sich die Bakterienarten ansiedeln. Schließlich messen wir die Reaktion der Nische auf bakterielle Kolonisatoren, einschließlich physikalischer Veränderungen und Glykosylierung der extrazellulären Matrix.
In früheren Arbeiten haben wir eine Reihe von Bakterienstämmen untersucht, die entweder mit im Labor oder in der Wildnis gefangenen D. melanogaster24 in Zusammenhang stehen, und dabei eine Untergruppe von Bakterienstämmen identifiziert, die den Darm von Laborfliegen effizient besiedeln. Um zu untersuchen, ob Kommensalbakterien in einer Weise, die mit der Existenz einer Nische vereinbar ist, stabile Assoziationen mit dem Fliegendarm eingehen, setzten wir Fliegen einem quantifizierten Inokulum von Bakterienzellen aus, die mit einem fluoreszierenden Protein markiert waren (Abb. S1A–G). Nach der Inokulation wurden die Fliegen 3 Tage lang täglich in keimfreies Futter überführt, gefolgt von einem weiteren 3-stündigen Transfer in ein neues keimfreies Fläschchen, damit sich vorübergehende Bakterien aus dem Darm entfernen konnten („Methoden“, Abb. S1). Die Reinigung vor der Analyse reduzierte die Gesamtzahl der Darmbakterien und die räumliche Variation der Bakterienlokalisation (Abb. S1H–J). Diese Experimente ergaben, dass ein Stamm von Lactiplantibacillus plantarum (Lp), der aus einer wild gefangenen Fliege (LpWF) isoliert wurde, ausschließlich im Vorderdarm von D. melanogaster (Abb. 1A–D, S1I,J) einschließlich des Proventriculus (einer verbindenden Lumenregion) persistiert die Speiseröhre mit dem vorderen Mitteldarm38), der Kropf (ein sackartiges Anhängsel) und der Kropfgang, der den Kropf mit dem Proventriculus verbindet. Bakterien, die mit Längsfurchen assoziiert sind, die die Oberfläche des inneren Lumens des Proventriculus, des Kropfgangs und der Basis des Kropfes auskleiden (Abb. 1C-D, S1J). Ähnliche räumliche Besiedlungsmuster traten bei erwachsenen begatteten Weibchen, jungfräulichen Weibchen und erwachsenen Männchen auf (Abb. S2A–J), was darauf hindeutet, dass geschlechtsspezifische Unterschiede keinen Einfluss auf den Phänotyp haben. Nach der Rodung wurde bei den Larven keine Kolonisierung beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Phänotyp spezifisch für den Vorderdarm des Erwachsenen ist (Abb. S2K – M). Wir konzentrieren uns durchgehend auf erwachsene, begattete Weibchen, da gezeigt wurde, dass sie eine geringe Variation der Darmphänotypen von Fliege zu Fliege aufweisen39,40,41.
Ein Schema des Kolonisierungstests mit der ersten Dosierung am Tag 0 und seriellen Übertragungen auf steriles Futter täglich für 3 Tage vor der Analyse. B Darmdiagramm. C-Mikroskopie der LpWF-mCherry-Kolonisierung im gesamten Darm nach der Entfernung transienter Zellen zeigt eine spezifische Kolonisierungszone im Vorderdarm. Dargestellt ist eine Z-Projektion mit maximaler Intensität. D Der Proventriculus ist ein Hauptstandort der LpWF-Kolonisierung. Die Kolonisierung mit E Ai ist auch spezifisch für das Lumen des Proventriculus und den Fruchtgang (siehe auch Abb. S2). F KBE-Dichten aus Regionen, die in B. präpariert wurden. n = 23 einzelne Eingeweide/Region aus drei biologischen Replikaten. Spalten repräsentieren Mittelwerte. Fehlerbalken sind SD G. Zur Entfernung des Kropfes wurde eine Mikrochirurgie durchgeführt. H LpWF besiedelt den Vorderdarm von Fliegen, nachdem die Ernte entfernt wurde (n = 15/15). I TEM-Querschnitt des inneren Lumens des Proventriculus. Repräsentatives Bild von n = 3 biologischen Replikaten. J Detail von (I). Maßstabsbalken werden in den Abbildungsfeldern definiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Ähnlich wie LpWF besiedelte ein Stamm von Acetobacter indonesiensis die gleichen Vorderdarmregionen (Abb. 1E, S2, S3), was darauf hindeutet, dass die beiden Hauptgruppen der Fliegendarmbakterien im Vorderdarm die gleiche räumliche Spezifität aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten mit Lp aus Laborfliegen (LpLF) (Abb. S1K, L) oder dem aus Menschen isolierten LpWCFS1-Stamm (Abb. S1M, S2A–J) kolonisierte Fliegen deutlich geringere Besiedlungsgrade. Nach der Beseitigung transienter Bakterien wurden im Mitteldarm oder anderen Regionen der Fliege keine Lp-Stämme in nennenswerter Häufigkeit gefunden. In Übereinstimmung mit der Mikroskopie war die Lebendbakteriendichte im Proventriculus am größten, gefolgt vom Kropf, und im Mitteldarm und Hinterdarm am niedrigsten (Abb. 1F, S1N). Wir haben außerdem bestätigt, dass LpWF eine stabile Kolonisierung aufrechterhält, auch wenn über einen Zeitraum von 5 Tagen keine neuen Bakterienzellen aufgenommen werden. Dabei wurden nicht anhaftende Bakterien aus dem Darm gespült, indem mithilfe eines CAFÉ-Futterspenders sorgfältig die Sterilität der Nahrung aufrechterhalten wurde24 (Abb. S4A, B).
Eine Bakterienpopulation im Vorderdarm mit der beobachteten räumlichen Lokalisierung könnte durch Proliferation und ständige Neuaussaat aus der Kulturpflanze aufrechterhalten werden. In diesem Fall könnten Fliegen ohne Kulturpflanzen nicht stabil besiedelt werden. Wir führten eine Mikrochirurgie durch, um die Ernte von keimfreien Fliegen zu entfernen (Abb. 1G, „Methoden“), inokulierten sie 5 Tage nach der Operation mit LpWF und sezierten und bildeten dann den Darm 5 Tage nach der Inokulation ab (dpi). Der chirurgische Erfolg wurde bestätigt und der verbleibende Teil des Krongangs wies an der Operationsstelle eine melanisierte Narbe auf (Abb. 1H). Alle erntelosen Fliegen wurden stabil von LpWF besiedelt (n = 15/15), mit einer hohen Bakteriendichte im inneren Lumen des Proventriculus wie bei Fliegen mit intaktem Kropf (Abb. 1C). Wir beobachteten eine ähnliche Ai-Kolonisierung nach der Kropektomie (n = 14/14 kolonisiert, Abb. S3E, F). Bei der weiteren Untersuchung dieser Regionen zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) des Proventriculus-Lumens eine konsistente Gewebegeometrie (Abb. 1I, J), mit dicht gepackten Bakterienzellen, die in Längsrichtung in länglichen Furchen ausgerichtet sind, die von Wirtszellkörpern gebildet werden und durchschnittlich 11 Grate bilden pro Querschnitt (Abb. S4C).
Daher ist die Kultur nicht für eine stabile Besiedlung des Vorderdarms durch LpWF oder Ai erforderlich, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den Proventriculus und den Fruchtgang der Schlüssel zu einer stabilen Bakterienassoziation ist.
Es ist zu erwarten, dass eine Nische aufgrund spezifischer Bindungsstellen zu einer starken bakteriellen Assoziation führt, so dass die Größe der zugehörigen Bakterienpopulation einen genau definierten Wert erreicht. Darüber hinaus wäre zu erwarten, dass bereits an den Proventriculus gebundene Zellen die Populationsstabilität fördern und die Kolonisierung später ankommender Bakterien verhindern. Um diese Hypothesen zu testen, haben wir keimfreie Fliegen mit verschiedenen Dosen LpWF-mCherry besiedelt und die Häufigkeit über die Zeit gemessen. Wie vorhergesagt, war die zugehörige Bakterienpopulation über einen weiten Bereich der anfänglichen Inokulumgrößen mit ~104 KBE/Fliege gesättigt (Abb. 2A). Wenn die Inokulumgröße außerdem unter diesem Sättigungswert lag, nahm die Bakterienpopulation im Proventriculus allmählich zu und erreichte innerhalb von 5 Tagen ein Plateau. Wachstumsmessungen an lebenden Fliegen24 zeigten, dass das Plateau durch das Wachstum der ursprünglich gebundenen Population und nicht durch die Aufnahme zusätzlicher Zellen erreicht wurde. Wenn dagegen anfänglich ein Überschuss an Bakterien zugeführt wurde, sank die Population innerhalb eines Tages auf den gleichen Plateauwert (Abb. 2A), was darauf hindeutet, dass die Nische über eine begrenzte und feste Tragfähigkeit verfügt. Eine ähnliche Dynamik wurde für Ai mit ~103 Zellen bei gesättigter Dichte beobachtet (Abb. S3G).
Eine Sättigung erfolgt über einen Besiedlungszeitraum keimfreier Fliegen durch LpWF. Datenpunkte sind der Mittelwert von log10 (KBE) in n ≥ 48 Fliegen/Datenpunkt. Fehlerbalken stellen 1 SEM dar. Einschub: 20-tägiger Zeitverlauf nach Inokulation mit 106 KBE (Daten aus 24). B Bakterielles Pulse-Chase-Versuchsdesign: Fliegen wurden zunächst mit LpWF-mCherry vorkolonisiert und dann täglich mit frischem Futter mit einem Überschuss an unmarkiertem LpWF (blau) gefüttert. C Akterialer Zellumsatz, quantifiziert durch den Pulse-Chase-Zeitverlauf von Lp-mCherry-vorkolonisierten Fliegen, die kontinuierlich mit unmarkiertem LpWF gefüttert wurden, oder Ai-GFP-vorkolonisierten Fliegen, die kontinuierlich mit unmarkiertem Ai gefüttert wurden. Datenpunkte sind Mittelwerte von log10 (KBE) in n ≥ 34 Fliegen/Datenpunkt. Fehlerbalken stellen die Kolonisierungseffizienz von 1 Sem D dar, quantifiziert durch die Dosisreaktion auf die Kolonisierung einzelner Fliegen. Die KBE wurden bei 3 dpi des zweiten Kolonisators gemessen. n = 24 Fliegen/Dosis, Fehlerbalken stellen 1 Standardfehler des Anteils dar. Nachweisgrenze: 50 KBE. E Räumliche Struktur der Kolonisierungsdynamik im Proventriculus für eine mit LpWF-mCherry (rot) vorkolonisierte Fliege, die von LpWF-GFP befallen und 1 Stunde nach der Inokulation abgebildet wurde (hpi). F Optischer x,z-Schnitt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Um die Stabilität der bakteriellen Besiedlung im Proventriculus zu untersuchen, führten wir ein Pulse-Chase-Experiment durch, bei dem wir mit LpWF-mCherry vorkolonisierte Fliegen über einen Zeitraum von 10 Tagen mit unmarkiertem LpWF im Überschuss gefüttert haben (Abb. 2B). Die LpWF-mCherry-Spiegel im Darm sanken in den ersten 5 Tagen um >90 %, von ~104 auf ~103 KBE/Fliege, und blieben dann für die folgenden 5 Tage bei ~103 KBE/Fliege (Abb. 2C), was auf a kleine, gebundene Population mit geringem Umsatz und einer größeren assoziierten Population mit einer Halbwertszeit von 2,5 Tagen (95 %-Konfidenzintervall (ci) 1,6–4,3 Tage). Im Gegensatz dazu wurde LpWCFS1, ein schwach kolonisierendes menschliches Isolat von L. plantarum, schnell aus dem Darm gespült (Abb. 2C). Eine ähnliche Dynamik wurde in Ai (Abb. 2C, S3H) mit einer Halbwertszeit von 2,5 Tagen (95 % ci 1,3–6,5 Tage) beobachtet, was darauf hinweist, dass die Nische für beide Bakterienarten eine gleichwertige Kinetik aufweist.
Die anfängliche Bindung an die Nische ist ein wichtiger Schritt bei der Etablierung einer neuen Bakterienpopulation vor dem Füllen der Nische. Die Etablierung ist dosisabhängig24, und unsere Feststellung, dass die endgültige Häufigkeit später Kolonisatoren geringer ist als die der anfänglichen Kolonisatoren (Abb. S4D), deutet darauf hin, dass die Anwesenheit früherer Kolonisatoren die Dosis-Wirkungs-Kurve verschieben würde. Um solche vorrangigen Effekte zu quantifizieren, haben wir einzelne mit LpWF vorkolonisierte Fliegen mit einer Reihe von Dosen LpWF-mCherry gefüttert und den Prozentsatz gemessen, der 3 Tage später mit LpWF-mCherry kolonisiert wurde. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese war die Wahrscheinlichkeit, dass vorkolonisierte Fliegen mit einer gleichen Dosis LpWF-mCherry kolonisiert wurden, geringer als bei keimfreien Fliegen: ~103 LpWF-mCherry-KBE waren für die Kolonisierung von 50 % der Fliegen erforderlich, während 100 % der Fliegen kolonisiert wurden Keimfreie Fliegen wurden schließlich bereits mit Dosen von nur 102 KBE kolonisiert (Abb. 2D). Diese Ergebnisse zeigen, dass die proventrikuläre Nische für LpWF, wenn sie besetzt ist, der Kolonisierung durch spätere Dosen desselben Stamms stark widersteht.
Der Zusammenhang zwischen der Etablierungswahrscheinlichkeit und der endgültigen Häufigkeit erfolgreicher Kolonisierung von Bakterien legt nahe, dass die Verfügbarkeit offener Lebensräume die Wahrscheinlichkeit einer Invasion reguliert. Wir haben die Annahmen dieser Hypothese formalisiert, indem wir eine integrierte Theorie der anfänglichen Kolonisierung24 und der Nischensättigung42 entwickelt haben, die die Wahrscheinlichkeit der Kolonisierung, \(P\left({N}_{0}\right)\, einer eindringenden Art, die bei a geimpft wurde, vorhersagt Dosis von \({N}_{0}\) als Funktion der endgültigen Häufigkeit der eindringenden Arten, \({A\left (\right. N}_{0}\left )\right.\):
Dabei ist \(p\) die Kolonisierungswahrscheinlichkeit einer einzelnen Bakterienzelle und \(k\) die Subpopulationsgröße, die bei einem einzelnen erfolgreichen Kolonisierungsereignis erreicht wird (Abb. S5A, B). Dieses Modell ermöglichte es uns, den Maßstab abzuschätzen, in dem die Population auf der Grundlage der Besiedlungswahrscheinlichkeiten und der gesamten Bakterienhäufigkeit strukturiert ist. Für LpWF gilt Gl. 1 schätzt eine Subpopulationsgröße von \(k\)=600 Zellen (Abb. S5C), was ungefähr der Anzahl der Zellen entspricht, die in einer einzelnen Furche enthalten sind.
Um zu testen, ob die spätere Dosis von LpWF-mCherry durch residentes LpWF räumlich ausgeschlossen wurde, konstruierten wir einen GFP-exprimierenden LpWF-Stamm und verfütterten ihn an mit LpWF-mCherry vorkolonisierte Fliegen. Wir haben ganze fixierte Därme 1 Stunde nach der Inokulation (hpi) abgebildet, um LpWF-GFP-Zellen einzufangen, bevor sie aus der Fliege austraten (Abb. 2E). Im Proventriculus waren die eindringenden LpWF-GFP entlang der Mittelachse des inneren Lumens lokalisiert, getrennt von der Lumenwand durch eine bis zu 10 µm dicke Schicht aus residentem LpWF-mCherry (Abb. 2E, F). Die hinteren Proventriculus-Furchen waren dicht mit LpWF-mCherry gefüllt, während LpWF-GFP in den Furchen weitgehend fehlte, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Furchen um Orte stabiler Besiedlung handelt. Wir haben bestätigt, dass die Fluorophore nicht für die unterschiedliche Kolonisierung verantwortlich sind, indem wir Fliegen, die mit unmarkiertem LpWF vorkolonisiert wurden, mit LpWF-mCherry gefüttert und das mCherry-Signal entlang des Darms bei 1 hpi und 24 hpi quantifiziert haben. Bei 24 hpi und einer Dosis von ~104 KBE zeigten mit LpWF vorkolonisierte Fliegen mikroskopisch nahezu nicht nachweisbares mCherry (Abb. S4E–H). Diese Ergebnisse belegen weiter, dass die Nische für LpWF in den Proventrikelfurchen liegt. Anders als bei der anfänglichen Kolonisierung, bei der Bakterien schnell in die Furchen eindringen und diese besiedeln, verhinderten frühere Kolonisatoren eine spätere Kolonisierung, was darauf hindeutet, dass es in den Furchen nur eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen für LpWF-Zellen gibt und dass diese Stellen durch die vorherige Kolonisierung gesättigt sind. In Übereinstimmung mit dieser Logik, dass die Nischenpriorität räumlich bestimmt ist, waren in den Fällen, in denen LpWF-GFP eine Kolonisierung zeigte (n = 5), GFP-markierte Zellen nebeneinander entlang einer Furche lokalisiert, anstatt gleichmäßig mit mCherry vermischt zu werden (Abb . S4I).
Interspezies-Interaktionen können erhebliche Auswirkungen auf die Kolonisierung von Ökosystemen haben, und zwar durch vorrangige Effekte, zu denen Wettbewerbsausschluss und -erleichterung gehören43,44,45,46,47. Da Ai und LpWF die gleiche allgemeine Stelle im Darm besiedeln (Abb. 1C–F, S3A–D) und jeder Stamm sich selbst ausschließt (Abb. 2D, 3A), erwarteten wir, dass sie sich gegenseitig ausschließen würden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Häufigkeit und Wachstumsrate jeder Art während der Co-Kolonisierung gemessen. Zu unserer Überraschung blieben beide davon unberührt (Abb. 3B, C, S6), was zeigt, dass die Arten die Nische unabhängig voneinander sättigen. Wir haben auch einen Dosis-Wirkungs-Assay durchgeführt, um festzustellen, ob Wechselwirkungen die Etablierung neuer Kolonisatoren beeinflussen. Im Gegensatz zum Selbstausschluss von Ai erleichterte die Vorkolonisierung von LpWF die Ai-Kolonisierung (Abb. 3A), während die LpWF-Kolonisierung durch das Vorhandensein von Ai nicht beeinträchtigt wurde (Abb. S6A – C). A. pasteurianus, eine phylogenetisch unterschiedliche Art von Acetobacter48, die in D. melanogaster49 häufig vorkommt, wurde ebenfalls durch LpWF erleichtert (Abb. S6D). Durch Hitze abgetöteter LpWF erleichterte die Ai-Kolonisierung nicht, was darauf hindeutet, dass lebende LpWF-Zellen notwendig sind, um die Ai-Kolonisierung zu erleichtern (Abb. S7A, B).
A-Stamm-Wechselwirkungen beeinflussen die Kolonisierungseffizienz, wie aus den Dosis-Wirkungs-Kurven für Ai hervorgeht, das an keimfreie Fliegen (offene grüne Kreise), mit Ai vorkolonisierte Fliegen (gefüllte gelbe Kreise) oder mit Lp vorkolonisierte Fliegen (schwarze Kreise) verfüttert wird. gefüllte grüne Quadrate). Z-Test der Unterschiede im Verhältnis zu Ai bei keimfreien Fliegen: Dosis 102,3 KBE/Fliege, p = 8,1×10−4; Dosis 103,7 KBE/Fliege: p = 4,8 × 10−9; Dosis 105 KBE/Fliege: p = 8,7 × 10−6. n ≥ 12 Fliegen/Datenpunkt. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Anteils dar. B Die Ai-Häufigkeit bei 5 dpi unterscheidet sich nicht zwischen mit Ai monokolonisierten und mit LpWF vorkolonisierten und dann mit Ai gefütterten Fliegen. n ≥ 65 Fliegen/Behandlung; zweiseitiger ungepaarter t-Test, p = 0,38; ns bedeutet nicht signifikant. C Die LpWF-Häufigkeit 5 dpi unterscheidet sich nicht zwischen mit LpWF monokolonisierten und mit Ai vorkolonisierten und dann mit LpWF gefütterten Fliegen. n ≥ 53 Fliegen/Behandlung; zweiseitiger ungepaarter t-Test; p = 0,06; ns bedeutet nicht signifikant. B, C: Die Mitte des Kastens ist der Mittelwert; Der Kasten umfasst das 25. bis 75. Perzentil; Whiskers zeigen Minimum und Maximum an. D Konfokale Mikroskopie der Kokolonisierung von Lp und Ai. Ai (grün) und LpWF (rot) besetzten die gleichen Regionen des Vorderdarms 1 dpi. Maßstabsleiste: 100 µm. E, F x,z-Abschnitt der Ai- und LpWF-Sektoren. G-TEM-Querschnitt von Ai und LpWF, die den vorderen Proventriculus gemeinsam besiedeln. Maßstabsleiste: 5 µm. H Detail von (G) mit pseudogefärbten LpWF- und Ai-Zellen. Maßstabsleiste: 2 µm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Die Fluoreszenzmikroskopie von mit LpWF-mCherry und Ai-GFP gemeinsam besiedelten Eingeweiden zeigte, dass Ai und LpWF dieselben Vorderdarmregionen gemeinsam besiedelten (Abb. 3D), mit unterschiedlichen Sektoren jeder Art (Abb. 3E–H, Zusatzfilm 1). . Somit schließen sich LpWF und Ai nicht physisch aus; Stattdessen nimmt das Gewebe beide Stämme auf.
Um die Koexistenz überlappender Ai- und LpWF-Populationen in einem physisch begrenzten Raum zu untersuchen, haben wir die Fliegenanatomie mithilfe der Röntgen-Mikrocomputertomographie (XR µCT)50,51 abgebildet und die volumetrischen Bilddaten segmentiert, um 3D-Rekonstruktionen zu erstellen (Abb. 4A). Wir haben keimfreie Fliegen und mit LpWF, Ai oder sowohl LpWF als auch Ai kolonisierte Fliegen abgebildet. Entlang des Darms waren zahlreiche Krypten erkennbar, auch in nicht besiedelten Regionen des Mitteldarms und Hinterdarms, die durch peritrophe Matrix abgeschirmt sind (Abb. 4A, S8)52. Im besiedelten Bereich des Vorderdarms stimmten die Längsstreifen, in denen wir Bakterien beobachteten, mit Graten und Furchen des Wirtsgewebes im inneren Lumen und Krongang des Proventriculus überein (Abb. 4B – F). Die Furchen waren im vorderen Proventriculus gerade und wurden im hinteren Bereich größer und unregelmäßiger (Abb. 4D, F). Querschnitte der Lumenwand zeigten einen schmalen Durchgang durch den keimfreien Proventriculus (Abb. 4C), während die Öffnung im kolonisierten Proventriculus viel breiter war (Abb. 4E), was einem deutlich höheren Lumenvolumen als im keimfreien entsprach Fliegen (Abb. 4G).
Ein Röntgen-µCT-Modell einer ganzen Fliege. Der Schnitt zeigt (1) den freigelegten Proventriculus (auch Einschub von (B)), (2) den vorderen Mitteldarm und (3) den hinteren Mitteldarm. B Detail von Proventriculus. C Querschnitt eines keimfreien Proventriculus-Innenlumens. Maßstabsleiste: 5 µm. D Darstellung des keimfreien Proventriculus-Innenlumenvolumens. E LpWF-kolonisierter Proventriculus-Innenlumenquerschnitt. Maßstabsleiste: 5 µm. F Darstellung des inneren Lumenvolumens von LpWF Proventriculus. G Kardiavolumen berechnet aus Oberflächenmodellen (n = 3 bis 4 Fliegen pro Bedingung; p = 0,0025, einfache ANOVA relativ zu keimfrei; Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche; GF vs. Lp p = 0,020; GF vs. Lp+ Ai p = 0,022.). H–M Transmissionselektronenmikroskopischer Querschnitt des vorderen Proventriculus in (H) keimfreier Fliege, (I) konventionell gezüchteter Fliege (nur Laborfliegenbakterien; kein LpWF), ( J, K) 1 hpi mit LpWF, ( L, M) 3 dpi mit LpWF kolonisiert (siehe Abb. S7). n ≥ 3 biologische Replikate pro Behandlung für TEM. Gelbe Pfeilspitzen zeigen den Lumenraum an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
In Übereinstimmung mit der XR-µCT-Bildgebung zeigten TEM-Querschnitte des Proventriculus keimfreier Fliegen einen schmalen Lumenraum mit einem Durchmesser von etwa 0,5 µm (Abb. 4H, S9). Eine ähnliche Morphologie wurde bei konventionell gezüchteten Laborfliegen beobachtet, die mit schlecht kolonisierenden Stämmen derselben Bakterienart, einschließlich L. plantarum24, assoziiert sind (Abb. 4I). Bei LpWF-kolonisierten Fliegen vergrößerte sich der Durchmesser der Furchen um 1 hpi auf ~1 µm (Abb. 4J, K, S9) und um 3 dpi auf ~2–3 µm (Abb. 4L, M, S9E–J), was darauf hindeutet eine nachhaltige Reaktion des Gastgebers auf die Besetzung von Nischen. Durch Hitze abgetöteter LpWF erzeugte diese Nischenerweiterung nicht, was darauf hindeutet, dass lebende LpWF-Zellen für die Lumenausdehnung erforderlich sind (Abb. S7C–F). Laut TEM enthielt der erweiterte Lumenraum des kolonisierten Proventriculus zwei Zonen: eine klare Zone neben der Lumenwand und eine mit Bakterien besiedelte Zone näher an der Mitte des Lumens (Abb. 4L, M, S9E–J). Die Hochdruck-Gefrierfixierung zeigte die gleichen Phänotypen (Abb. S9S), was darauf hindeutet, dass die Zonierung nicht einfach ein Fixierungsartefakt ist. Zusammenfassend zeigen unsere Bildgebungsergebnisse, dass der Proventriculus bei der Kolonisierung morphologische Veränderungen erfährt, die mit der Förderung der Ai-Kolonisierung zusammenfallen.
Schleim ist stark glykosyliert und umfasst je nach Art des Schleims verschiedene Glykan-Untereinheiten, darunter N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalatosamin, N-Acetylneuraminsäure, Mannose, Glucose, Fucose und Arabinose53. Wir stellten die Hypothese auf, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der besiedelten Zone des inneren Lumens des Proventriculus, wie im Dünnschnitt-TEM (Abb. 4, S9) zu sehen ist, reich an Glykanen ist. Um diese Hypothese zu testen, haben wir den Proventriculus geschnitten und mit einer Reihe von Lektinen gefärbt, die eine Spezifität für im Schleim vorkommende Glykane aufweisen („Methoden“). Weizenkeim-Agglutinin (WGA), Dolichus biflorus-Agglutinin (DBA) und Lens culinarus-Agglutinin (LCA) färbten Fliegenzellen in den Proventriculus-Schnitten, während andere Lektine keine konsistente Bindung an den Proventriculus zeigten (Abb. 5A). Bei der Untersuchung des inneren Lumens des Proventriculus, wo die sezernierte Schicht durch TEM erscheint (Abb. 4H–M, S9), beobachteten wir eine Färbung durch WGA (Abb. 5B). Im inneren Lumen waren auch DBA- und LCA-Färbungen vorhanden, die Stellen entsprachen jedoch nicht der im TEM sichtbaren Sekretionsschicht (Abb. S10A, B). WGA bindet N-Acetylglucosamin und kann auch N-Acetylneuraminsäure54 binden, die wichtigste Sialinsäure, die in Säugetierzellen vorkommt. Sambucus nigra-Agglutinin, das Sialinsäuren bindet, zeigte keine Färbung, was mit veröffentlichten Berichten übereinstimmt, dass Sialinsäure nur in Fliegenembryonen vorkommt55. Succinyliertes WGA (sWGA) bindet nur N-Acetylglucosamin54 und zeigte ein Färbemuster, das mit WGA- und TEM-Bildern der sezernierten Schicht übereinstimmt, was darauf hinweist, dass die ECM im inneren Lumen reich an N-Acetylglucosamin ist (Abb. 5C). Chitin ist ein Polymer von N-Acetylglucosamin, und im Proventriculus ist auch eine durchlässige, chitinhaltige Kutikula vorhanden38. Calcofluor, das Chitin bindet, färbte die Kutikula, die deutlich zwischen den Epithelzellen des inneren Lumens und der Sekretionsschicht zu sehen ist, was darauf hindeutet, dass es sich bei der Sekretionsschicht nicht um Chitin handelt (Abb. 5B, C). TEM deutete darauf hin, dass keimfreie Fliegen auch eine schmale Sekretschicht haben (Abb. 4H). Wir analysierten keimfreie Fliegen und stellten fest, dass diese schmale Schicht mit WGA gefärbt war, was darauf hinweist, dass N-Acetylglucosamin ein primäres Glykan in der sezernierten Schicht keimfreier Fliegen ist (Abb. 5D, S10C). Um festzustellen, ob die Schicht das Produkt von verdautem Chitin aus Hefezellwänden in der Nahrung sein könnte, haben wir frisch geschlüpfte, jungfräuliche Weibchen vor ihrer ersten Fütterung geschnitten und festgestellt, dass die Färbung ihrer Proventriculus mit keimfreien Fliegen übereinstimmt (Abb. 5E, S10D). , E). Da sich der Proventriculus während der Verpuppung aus einer Imaginalscheibe bildet, deuten unsere Erkenntnisse darauf hin, dass das abgesonderte N-Acetylglucosamin-reiche ECM eindeutig von der Fliege produziert wird.
Eine Tabelle mit Lektinen, die den Proventriculus färbten. Lektinfärbung von Proventriculus-Querschnitten für B WGA in einer kolonisierten Fliege, C sWGA in einer kolonisierten Fliege, D WGA in einer keimfreien Fliege und E WGA in einer frisch geschlüpften keimfreien Fliege vor der ersten Nahrungsaufnahme. Maßstabsbalken: 20 µm. Pfeilspitzen weisen auf eine Lektinfärbung im inneren Lumen des Proventriculus hin. n ≥ 3 biologische Replikate pro Behandlung. CF: Calcofluor.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Stämme von Drosophila-Darmbakterien kryptartige Furchen im Proventriculus besiedeln, dass die Kolonisierung durch diese Stämme sättigbar ist, was auf eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen schließen lässt, und dass der Proventriculus auf die Kolonisierung durch Stauung reagiert, was die Kolonisierung durch fördert Bakterien, die der Fliege zugute kommen32,33,56. Die Feststellung, dass Drosophila eine spezifische Nische für die Bindung von Kommensalen an Stellen im Fruchtgang und im Proventriculus hat, ist bedeutsam, weil sie Erkenntnisse darüber liefert, wie ein Mikrobiom mit dem Wirt auf eine vom Wirt regulierte und für beide Seiten vorteilhafte Weise interagieren kann. Darüber hinaus sagt es die Existenz spezifischer Moleküle in der extrazellulären Matrix des Proventriculus voraus, die an die Bakterienoberfläche kolonisierungskompetenter Stämme binden, nicht jedoch an nicht kolonisierende Stämme. Obwohl wir Mucine hier nicht untersucht haben, verfügen Fliegen über Mucine57,58, und drei davon werden im Proventriculus exprimiert52. Darüber hinaus erinnert die Morphologie der extrazellulären Matrix im Proventriculus an Säugetierschleim, der aus zwei Schichten besteht: einer dichten, unbesiedelten Schicht neben dem Epithel und einer dünneren, distalen Schicht, die von Bakterien besiedelt ist59. Wir spekulieren, dass die Nischenzellen in den Proventrikelfurchen entweder das Adhäsionssubstrat für die Bakterien produzieren oder eine extrazelluläre Matrix produzieren, die das Adhäsionssubstrat aus einer anderen Quelle, beispielsweise der Speicheldrüse, bindet. Die scheinbar dicht gestapelten Membranen, die durch TEM der Nischenzellen beobachtet wurden (Abb. 1J), lassen darauf schließen, dass es sich möglicherweise um sekretorische Zellen handelt, was mit der ausgedehnten sekretorischen Natur des Proventriculus 38 übereinstimmt. Die Erkenntnis, dass die Bindung eines Bakterienstamms zu strukturellen Veränderungen führen kann, die Nischenplätze für eine zweite Bakterienart öffnen, liefert ein Modell dafür, wie komplexe Ansammlungen von Bakterienstämmen entstehen und im Verdauungstrakt eines Wirts aufrechterhalten werden können, wobei der Wirt primäre Kolonisatoren auswählt wiederum wählen sekundäre Kolonisatoren aus. Tatsächlich ist L. plantarum homofermentativ, und wir haben zuvor gezeigt, dass LpWF eine positive metabolische Wechselwirkung mit Acetobacter-Stämmen hat, die im Fliegendarm vorkommen, einschließlich Ai60.
Trotz der langen Geschichte von Studien zum Drosophila-Mikrobiom wurde die Existenz einer bestimmten Nische durch das Vorhandensein von Bakterien in der Nahrung und auf traditionellen Kulturmedien verschleiert. Ein erheblicher Teil der Darmbakterien passiert unter solchen Bedingungen einfach den Darm und interagiert nicht spezifisch mit ihm61, obwohl möglicherweise bestimmte Mikrobiommitglieder vorhanden sind, die an die zugehörigen Nischen gebunden sind. Wir verwendeten bakterielle Pulse-Chase-Protokolle, um ungebundene Bakterien auszutreiben. Dieser methodische Fortschritt wurde nur für spezifisch interagierende Zellen angereichert und ermöglichte uns die Identifizierung der symbiotischen Nische.
Der Besitz eines Mikrobioms ist für Drosophila eindeutig von großem Nutzen, da axenische Fliegen ein stark reduziertes Wachstum und eine stark verminderte Fruchtbarkeit aufweisen29,30,31,32,62,63. Es ist jedoch weniger klar, wie die Beziehung zwischen dem Wirt und bestimmten Bakterienstämmen stabil aufrechterhalten wird. Eine frühere Studie zeigte, dass Larven N-Acetylglucosamin in ihrem Futter ausscheiden und so einen Nährstoff liefern, der das externe Wachstum von L. plantarum auf Fliegenfutter unterstützt37. Während der Ursprung des N-Acetylglucosamins der Larven nicht bestimmt werden konnte, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Nische des erwachsenen Proventriculus mit von Fliegen produziertem N-Acetylglucosamin angereichert ist, was darauf hindeutet, dass die Nische sowohl einen räumlichen Lebensraum als auch eine Nahrungsquelle für L. plantarum bietet.
Das Verständnis der proventrikulären Nische wird wahrscheinlich Einblicke in die Funktion des Mikrobioms liefern, indem es (1) die räumlichen Orte aufdeckt, an denen Bakterien den Wirt beeinflussen, um Moleküle in den Darm einzuführen, möglicherweise zusammen mit der peritrophen Membran; und indem (2) aufgedeckt wird, ob durch eine Art induzierte Veränderungen in der Nischenstruktur die Grundlage für komplexere Assoziationen zwischen verschiedenen Mitgliedern des Mikrobioms wie LpWF und Ai bilden, die mit ihren Funktionswegen zusammenhängen. Schließlich werfen diese Beobachtungen die Frage auf, ob an anderen Stellen im Verdauungssystem von Drosophila und im Darm anderer Tiere, einschließlich des Menschen, zusätzliche Nischen existieren.
Es wurde keine ethische Genehmigung eingeholt, da für Insektenmodelle gemäß den örtlichen Gesetzen und Vorschriften keine ethische Genehmigung erforderlich ist. Bei allen Fliegen in dieser Studie handelte es sich um begattete Weibchen (außer in Abb. S2), die eine geringe Heterogenität in der Darmmorphologie aufweisen40. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die von uns gemessenen Kolonisierungsphänotypen für mehrere genetische Hintergründe gelten, darunter CantonS, w1118 und OregonR24. Die Fliegen wurden in breiten Drosophila-Fläschchen (Kat.-Nr.: 32-114, Genesee) mit Droso-Plugs® (Kat.-Nr.: 59-201, Genesee) aufgezogen. Die Nahrungszusammensetzung bestand aus 10 % Glucose (filtersterilisiert), 5 % autoklavierter Lebendhefe, 0,42 % Propionsäure (filtersterilisiert), 1,2 % autoklaviertem Agar und 0,5 % autoklaviertem Maismehl. Jede Durchstechflasche enthielt 4 ml Futter. Keimfreie Fliegenvorräte wurden alle 3–4 Tage in frische Fläschchen überführt. Fünf Tage alte, verpaarte erwachsene weibliche Tiere wurden am Tag vor Beginn eines Experiments sortiert.
Flüssige Nahrung bestand aus 10 % Glucose, 5 % Hefeextrakt und 0,42 % Propionsäure. Der einzige ernährungsphysiologische Unterschied zwischen flüssiger und fester Nahrung bestand im Hefeextrakt anstelle von autoklavierter Lebendhefe, da die Hefezellwände die für die Flüssigfütterung verwendeten Kapillaren verstopfen. Der Boden der Kapillar-Feeder-Fläschchen enthielt 1,2 % Agar als Hydratations- und Feuchtigkeitsquelle. Sowohl mit CAFÉ als auch mit fester Nahrung gefütterte Fliegen wurden täglich in frische Fläschchen überführt, um die erneute Aufnahme von Bakterien zu minimieren. Fliegenproben wurden oberflächensterilisiert und zerkleinert und die KBE wurden gezählt.
Bakterienstämme wurden in Lit. angegeben. 24, einschließlich Lactobacillus plantarum WF, L. plantarum LF und L. plantarum WCFS1, das in Lit. als L. plantarum HS bezeichnet wurde. 24. Acetobacter indonesiensis SB003 wurde in Abb. S1 von Lit. auf Kolonisierung getestet. 24. Fluoreszierende Protein-exprimierende Plasmidstämme wurden entwickelt und in Lit. beschrieben. 24,60. pCD256-p11-mCherry, verwendet für L. plantarum, war das großzügige Geschenk von Reingard Grabherr (BOKU, Österreich)64. pCM62, das für Acetobacter indonesiensis verwendet wird, war die großzügige Spende von Elizabeth Skovran (SJSU, USA).
Der Kolonisierungstest folgte dem in Abb. S1A von Lit. verwendeten Protokoll. 24. Kurz gesagt, eine abgemessene Dosis Bakterien wurde gleichmäßig auf die Oberfläche eines keimfreien Fliegenfutterfläschchens pipettiert und 15 Minuten lang absorbieren gelassen. Fünfundzwanzig keimfreie, 5 bis 7 Tage nach der Eklosion verpaarte weibliche Fliegen wurden in das Fläschchen gegeben und konnten sich über einen definierten Zeitraum ernähren. Anschließend wurden die Fliegen aus dem Impfgefäß entfernt und in frische, keimfreie Gefäße gegeben. Durch kräftiges Spülen mit PBS wurden Bakterien aus dem Impffläschchen gesammelt und die Häufigkeit durch KBE quantifiziert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die KBE in einzelnen Fliegen gezählt, indem die Fliegen sechsmal in 70 %igem Ethanol gewaschen, anschließend in ddH2O gespült und anschließend zur KBE-Zählung zerkleinert und plattiert wurden.
Bakterienkulturen wurden über Nacht in 3 ml flüssigem Medium bei 30 °C gezüchtet. Lp-Stämme wurden in MRS-Flüssigmedium (Hardy Diagnostics, Nr. 445054) gezüchtet, und für mCherry-exprimierende Stämme wurden 10 µg/ml Chloramphenicol hinzugefügt. Ai wurde in MYPL-Medium gezüchtet und für GFP-exprimierende Stämme wurden 25 µg/ml Tetracyclin hinzugefügt. Die Bakterien wurden durch 3-minütiges Zentrifugieren bei 400 × g pelletiert, in PBS resuspendiert und dann auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Die Dosisgröße wurde mithilfe von OD600 oder durch Ausplattieren und Zählen von KBE quantifiziert. Eine OD von 1,0 entspricht 2 × 108 KBE/ml für LpWF und 3 × 108 KBE/ml für Ai.
Die Fliegen wurden durch Pipettieren von 50 µL einer geeigneten Konzentration des Inokulums auf das Futter geimpft und dann 15 Minuten lang in der Biosicherheitswerkbank trocknen gelassen. Die Fliegen wurden 4 Stunden lang ausgehungert, bevor sie in die Impffläschchen umgedreht wurden, wo sie eine Stunde lang fressen durften und dann in frische Fläschchen umgedreht wurden. Die Dosis pro Fliege wurde als Menge des verbrauchten Inokulums dividiert durch die Anzahl der Fliegen im Fläschchen berechnet. Um zu überprüfen, ob die Fliegen die auf dem Futter platzierten Bakterien gefressen haben, und um die Menge des aufgenommenen Inokulums zu messen, wurden nach dem Füttern nicht gefressene Bakterien aus dem Fläschchen entnommen und von der ursprünglichen Dosis abgezogen. Für Experimente zur Standardisierung der Bakteriendosis verwendeten wir ein umgedrehtes konisches 50-ml-Fläschchen mit verfestigtem Agar-Nahrungsmittel im Deckel, was eine Trennung der Lebensmittel-KBE von den KBE an den Wänden des Fläschchens ermöglicht. Für andere Experimente verwendeten wir ein autoklaviertes Weitfliegenfläschchen aus Polypropylen (Genesee).
Die Larven wurden besiedelt, indem zunächst Futterfläschchen mit 100 µl Bakterienkultur bei einer OD von 1 beimpft wurden. Mindestens 25 begattete weibliche Fliegen wurden in die Fläschchen gegeben und konnten einen Tag lang Eier legen, bevor sie entfernt wurden. 3 Tage später wurden die Larven im dritten Stadium gesammelt und in PBS gewaschen und dann 4 Stunden lang in sterile Agarwasserfläschchen überführt, um vorübergehende Bakterien zu entfernen. Larvendärme wurden im Ganzen präpariert, dann in Eindeckmedium (80 % Glycerin, 20 % Tris 0,1 M pH 9,0) eingelegt und dann mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um einen Z-Stapel des gesamten Proventriculus zu erfassen.
Die Häufigkeit im Darm wurde durch Homogenisieren ganzer Fliegen und anschließendes Ausplattieren zur Zählung der KBE gemessen. Die Fliegen wurden zunächst mit CO2 anästhesiert und durch zweimaliges Waschen in 70 %igem Ethanol und dann zweimal in PBS oberflächensterilisiert. Anschließend wurden sie zusammen mit 100 µL PBS und ca. 50 µL 0,5 µm großen Glasperlen (Biospec) einzeln in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte gegeben und heißversiegelt (Thermal Bond Heat Seal Foil, 4titude). Die Platte wurde 4 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit auf einem Perlenrührer (Biospec Mini-beadbeater-96, Nr. 1001) heftig geschüttelt, um die Fliegen zu homogenisieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Kügelchengröße von 0,5 µm die Bakterienzahl nicht verringert und Fliegengewebe effektiv zerstört24. Eine Verdünnungsreihe der gesamten Platte wurde mit einem Liquid-Handling-Roboter (Benchsmart) hergestellt. Das Agar-Wachstumsmedium wurde in rechteckigen Tablettplatten hergestellt, die vor dem Ausplattieren etwa 30 Minuten lang erwärmt und getrocknet wurden. Die Platten wurden mit 2 µL Fliegenhomogenat pro Vertiefung beimpft, was zu einem kreisförmigen Feld für die KBE-Zählung führt. Die Platten wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert. Um die Kolonien zu zählen, wurden die Platten unter Fluoreszenzlicht fotografiert und halbautomatisch mit ImageJ 2.1.065 gezählt.
Die Anzahl der Bakterien in einem Fliegenfläschchen wurde gemessen, indem Zellen aus dem Fläschchen gewonnen und auf Nähragar-Wachstumsmedium (MRS oder MYPL) ausplattiert wurden, um die KBE zu zählen. Um Bakterien zu sammeln, wurden 2 ml steriles PBS in das Fläschchen pipettiert. Das Fläschchen wurde dann wieder verschlossen und 10 s lang gevortext. Eine Verdünnungsreihe wurde ausgehend von 100 µL der PBS-Waschlösung erstellt und dann ausplattiert, um die KBE zu zählen. Diese Methode wurde verwendet, um lebensfähige Bakterien, die von Fliegen ausgeschieden (ausgeschieden) wurden, oder das Bakterienwachstum im Fläschchen oder im Rest des nicht gefressenen Inokulums zu quantifizieren. Die Aufnahme und Inokulation wurde über einen Zeitraum von 1–2 Stunden gemessen, wodurch die Möglichkeit für das Wachstum neuer Bakterien minimiert wurde.
Zwölf Fliegen wurden in ein steriles Weithals-Fliegenfläschchen aus Polypropylen gegeben, das 2 ml 1,2 % Agar in ddH2O enthielt. Vier Glaskapillarröhrchen wurden durch den Flug eingeführt und mit 12 µL filtersterilisiertem flüssigem Fliegenfutter (10 % Glucose, 5 % Hefeextrakt, 0,42 % Propionsäure) gefüllt. Darüber wurden zehn Mikroliter Overlay-Öl gegeben, um die flüssige Nahrung auf den Boden der Kapillare zu drücken. Die Fliegen wurden 24 Stunden lang im Fläschchen belassen, bevor sie in einen neuen Ansatz überführt wurden. Die Fläschchen wurden alle 12 Stunden überprüft, um sicherzustellen, dass die Fliegen Zugang zu Nahrung hatten, und ein neuer Flügel mit neuen Kapillaren wurde eingesetzt, wenn sich in den Kapillaren Luft befand, was den Zugang zu Nahrung verhinderte. Fünf Fliegenfläschchen wurden in ein 1-L-Becherglas gegeben, mit einem feuchten Papiertuch am Boden und Aluminiumfolie darüber, und das Becherglas wurde für 12 bis 12 Stunden auf die Rückseite eines auf 25 °C eingestellten Fliegeninkubators gestellt Hell-Dunkel-Wechsel und 60 % relative Luftfeuchtigkeit.
LpWF-Bakterien wurden durch Züchten einer Übernachtkultur in MRS + 10 µg/ml Chloramphenicol bei 30 °C hergestellt. Die Kultur wurde durch Zentrifugation bei 400 × g pelletiert und dann in PBS bei einer OD von 2 resuspendiert. Um die Bakterien abzutöten, wurde 1 ml der resultierenden Suspension in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in den USA 30 Minuten lang auf 65 °C erhitzt Wissenschaftliches Mini-Trockenbad. Eine Probe der Suspension wurde auf einer MRS-Platte verteilt und zwei Tage lang inkubiert, um zu bestätigen, dass alle Zellen erfolgreich abgetötet wurden.
Um die Besiedlung durch lebendes LpWF zu simulieren, wurden Fliegen 3 Tage lang täglich mit einem Überschuss an durch Hitze abgetöteten Bakterien gefüttert. 5 bis 7 Tage alte, begattete weibliche Fliegen wurden wie in den anderen Kolonisierungsexperimenten mit 25 Fliegen/Fläschchen gehalten. Jeden Tag wurden 100 µL der durch Hitze abgetöteten Suspension (4 × 107 KBE/Fläschchen) auf frisches, steriles Futter pipettiert und trocknen gelassen, bevor die Fliegen in das Fläschchen überführt wurden. Um überschüssige abgetötete Bakterien aus der Nische zu entfernen, bevor Experimente zur Bewertung der Auswirkungen auf den Wirt durchgeführt wurden, wurden die Fliegen über Nacht in frisches, steriles Futter überführt und dann weiter entfernt, indem sie 4 Stunden lang auf Agar-Wasser-Medium gelegt wurden, bevor sie abgebildet oder mit Ai dosiert wurden. Von diesem Zeitpunkt an waren die Methoden dieselben, als ob Fliegen mit unserer Standardmethode kolonisiert würden.
Um die Umsatzzeit etablierter Bakterienpopulationen abzuschätzen, wurden 5 bis 7 Tage alte, begattete weibliche Fliegen mit 25 Fliegen pro Fläschchen gehalten. Die Fliegen wurden zunächst mit einem Impuls aus fluoreszierend markierten, antibiotikaresistenten Bakterien inokuliert, indem 50 µL der in PBS (OD600 = 1) resuspendierten Kultur auf das Futter pipettiert und trocknen gelassen wurden, bevor die Fliegen in das Impffläschchen gewendet wurden. Der Pulsdosis wurde erlaubt, vor der Verfolgung 3 Tage lang eine Kolonisierung im Darm zu etablieren. Den Fliegen wurde 10 Tage lang jeden Tag auf die gleiche Weise eine Chase-Dosis verabreicht (OD600 = 1). Die Häufigkeit der markierten Bewohner wurde täglich durch Homogenisieren und Ausplattieren einer Fliegenprobe auf selektivem Medium zur Zählung der KBE gemessen. Die eindringende Chase-Dosis wurde durch Ausplattieren auf nicht-selektiven Medien bestimmt. Um andere Faktoren zu kontrollieren, die sich auf die Häufigkeit der Bewohner auswirken könnten, wurde eine Kontrollgruppe außerdem täglich auf frisches Futter ohne Chase-Dosis umgestellt und täglich auf die Anzahl der KBE untersucht.
Messungen einzelner Fliegen aus den verschiedenen Experimenten wurden nach Zeitpunkt zusammengefasst. Die Daten wurden mit Prism an einen exponentiellen Zerfall angepasst und die Halbwertszeit mit ihrem Konfidenzintervall wurde angegeben.
Der Plasmidverlust ohne Selektion wurde als Indikator für die Wachstumsrate der Bakterien herangezogen24. Kurz gesagt wurde eine Standardkurve erstellt, indem plasmidhaltige Zellen zweimal täglich in frischem Medium in einer Verdünnung von ~ 1:100 bis zu einer OD von 0,01 für 6 Tage passagiert wurden. Die Anzahl der Bakteriengenerationen wurde durch Zählen der Anzahl der KBE in der Kultur vor der Verdünnung geschätzt. Das Verhältnis von plasmidhaltigen KBE zu plasmidfreien KBE wurde als Anzahl der fluoreszierenden zu nicht fluoreszierenden Kolonien gezählt. Die Verdopplungszeit beträgt für jeden Stamm etwa 2 Stunden. Zur Anpassung der Standardkurvendaten wurde eine lineare Regression verwendet. Anschließend wurden die Fliegen mit 100 % plasmidhaltigen Zellen gefüttert. Das Verhältnis von plasmidhaltigen zu plasmidfreien KBEs wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gezählt und die Standardkurve wurde verwendet, um das Verhältnis in die Anzahl der Verdoppelungen umzuwandeln. Im Fall von Dual-Plasmid-enthaltenden Stämmen (Abb. S7C) wurde das Wachstum als Verhältnis von Kolonien gemessen, die positiv für GFP-Erm-Plasmide waren (die schnell verloren gehen), zu Kolonien, die positiv für mCherry-Cam waren (das viel länger erhalten bleibt). Es wurde eine nichtlineare Regression (exponentieller Abfall) verwendet. Zwei Vorbehalte bestehen darin, dass (1) Populationsengpässe eine größere Varianz im Plasmidverhältnis verursachen und (2) die In-vivo-Plasmidverlustraten von den In-vitro-Raten abweichen können. Wir haben zuvor gezeigt, dass der erste Vorbehalt verwendet werden kann, um auf Engpässe zu schließen. Im Hinblick auf den zweiten Vorbehalt stellen wir außerdem fest, dass unsere Verwendung dieser Methode zum Vergleich der Wachstumsraten in einem kontrollierten Experiment keine Messung des absoluten Wachstums mit einer Standardkurve erfordert. Darüber hinaus waren die Wachstumsraten in vivo ähnlich wie in vitro, was bedeutet, dass etwaige Unterschiede in den Plasmidverlustraten aufgrund von Unterschieden in der Wachstumsphase der Zellen wahrscheinlich gering sind.
Die Kropektomie wurde an lebenden Fliegen nur mit neuen, unbeschädigten feinen Pinzetten (Nr. 5, Dumont) durchgeführt. Zangen, Flypad und Mikroskopbereich wurden mit 70 % Ethanol gereinigt. Fünf bis zehn Tage alte weibliche Fliegen wurden zunächst mit CO2 betäubt und dann zur Operation auf einen Depressionsobjektträger gelegt. Die Fliege wurde auf den Rücken gelegt, und während man den Rumpf mit einer Pinzette festhielt, wurde ein kleiner Einstich in den Bauch direkt unterhalb des Brustkorbs vorgenommen, wie in Abb. 1O dargestellt. Der Druck auf die Pinzette wurde leicht verringert, damit sich die Spitzen öffnen konnten. Anschließend wurde das Kropfstück gegriffen und durch die Punktion herausgezogen. Sofern der Krongang noch vorhanden war, wurde dieser an der Kante einer Pinzette durchtrennt. Die Fliegen wurden in ein steriles Futterfläschchen gegeben und erhielten mindestens 3 Tage Zeit, sich zu erholen. Die Überlebensrate schwankte je nach Betreiber zwischen 1 von 10 Fliegen und 2 von 3 Fliegen.
Ganze Eingeweide wurden der Fliege durch Präparation mit einer feinen Pinzette (Dumont) entnommen. Das Gewebe wurde 3 Stunden lang bei 24 °C oder über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA in PBS fixiert. Die Eingeweide wurden mit 0,1 % Triton-X in PBS 30 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert, zweimal in PBS gewaschen, 30 Minuten lang mit 10 µg/ml DAPI gefärbt, zweimal in PBS gewaschen und dann bis zu 1 Stunde lang in Eindeckmedium gegeben Mit einer 200-µL-Pipette mit großem Durchmesser auf den Objektträger übertragen. Jeder Darm wurde dann auf einem positiv geladenen Objektträger aus Glas positioniert und etwa 60 µl Eindeckmedium hinzugefügt (Eindeckmedium: 80 % Glycerin, 20 % 0,1 M Tris 9,0, 0,4 g/l N-Propylgallat). Dem Eindeckmedium wurden fünf bis zehn 0,1-mm-Glaskügelchen (Biospec) zugesetzt, um einen Abstandshalter zu bilden, der ein Zerdrücken der Probe verhindert. Der Objektträger wurde dann mit einem Deckglas Nr. 1,5 abgedeckt und mit Nagellack versiegelt.
Die Mikroskopie wurde mit einem konfokalen Leica DMi8-Mikroskop unter Verwendung eines 40× (1,30 NA) HC Plan Apo oder eines 60× (1,40 NA) HC Plan Apo Ölimmersionsobjektivs durchgeführt. Laserlinien wurden mit einem Weißlichtlaser mit AOTF-Kristall erzeugt und die Anregungswellenlängen für Fluorophore waren: mGFP5, 488 nm; mCherry, 591 nm; Cy5, 650 nm. Bilder des gesamten Darms wurden durch Kacheln mehrerer Aufnahmen und anschließendes Zusammenführen mit der Funktion „Mosaic Merge“ in der Leica Application Suite LAS X erstellt, um sie zu einem einzigen Stapel zusammenzufügen. Z-Stapel für ganze Därme hatten eine Dicke von 70–80 µm mit Scheiben alle 0,5 µm oder weniger. Um zweidimensionale Bilder für die Veröffentlichung zu rendern, wurden Fluoreszenzkanäle als Z-Projektionen maximaler Intensität verarbeitet und der Hellfeldkanal wird durch einen einzelnen Z-Schnitt aus der Mitte des Stapels dargestellt.
Die räumliche Verteilung der Darmbesiedlung wurde anhand von Mikroskopiebildern quantifiziert, wobei FIJI zur Maskierung und Segmentierung der Darmregionen aus den Bildern und MATLAB zur Quantifizierung des Ausmaßes der Besiedlung verwendet wurde. Zunächst wurden in Fidschi summierte Intensitäts-Z-Projektionen von optischen Abschnitten mit 80 µm erzeugt und dann auf einen Maßstab von 1 µm/px verkleinert. Es wurde eine Hintergrundsubtraktion mit einem rollenden Kugelradius von 50 px angewendet. Äquivalente Messungen wurden an keimfreien Eingeweiden durchgeführt, um die Autofluoreszenz des Darms zu quantifizieren, die je nach Region variiert.
Als nächstes wurde eine segmentierte Linie mit einer Spline-Anpassung und einer variablen Breite von 40–200 µm, abhängig von der Darmbreite der jeweiligen Region (z. B. 200 µm für den breiten Teil der Ernte und 40 µm für den Proventriculus), entlang der Linie gezogen Länge des Darms, beginnend mit dem distalsten Punkt des Kropfes als Ursprung. Die Funktion „Plotprofil“ wurde verwendet, um die Intensität entlang jedes der 11 Segmente zu messen: Frucht (2 Segmente), Fruchtgang (2 Segmente), Fruchtgang-Proventriculus-Verbindung (1 Segment), Proventriculus (1 Segment), Mitteldarm (3). Segmente) und Hinterdarm (2 Segmente). Diese Intensitätsprofile wurden dann nach MATLAB exportiert.
In MATLAB wurde die Segmentlänge für jede Darmregion mithilfe einer bilinearen Anpassung auf die durchschnittliche Länge jedes Segments kalibriert. Dieser Schritt führte dazu, dass alle Eingeweide ausgerichtet waren und die gleiche Gesamtgröße hatten, sodass wir die Intensität für jede Region des Darms über die replizierten Eingeweide hinweg vergleichen konnten. Der Wert jedes Intensitätswerts entlang des Splines wurde dann vom Hintergrund abgezogen und auf die Intensität der visuell bestätigten Bakterien in dieser Region normiert. Dieser Schritt gleicht die Variation der Autofluoreszenz entlang des Darms aus (am höchsten im Kropf und Hinterdarm) und gleicht die Unterschiede in der Fluoreszenzintensität der Bakterien aufgrund unterschiedlicher Gewebetiefen aus. Nach diesem Normalisierungsschritt wurde ein gleitender Durchschnittsfilter von 100 µm innerhalb der Grenzen jeder Darmregion angewendet, um die räumliche Variation im kleinen Maßstab zu glätten. Um jeden räumlichen Ort entlang des Darms von der Intensität der Besiedlung in besiedelt/nicht besiedelt umzuwandeln, haben wir die Intensität jedes Darms anhand einer visuellen Inspektion bestimmt. Der Anteil aller Eingeweide mit Besiedlung an jeder Stelle entlang des Splines wurde dann in den Abbildungstafeln aufgetragen. Darüber hinaus wird die Anzahl der Eingeweide mit >5 % Besiedlung in jeder der abgegrenzten Regionen als Prozentsatz für jede der Regionen wie folgt angegeben: Kropf, Fruchtgang, Proventriculus, Mitteldarm, Hinterdarm.
Um das Ablösen von Polystyrolkügelchen (Spherotech FP-0552-2, himmelblau) zu messen, wurde Durchflusszytometrie verwendet, um die Anzahl der ausgeschiedenen Kügelchen zu quantifizieren. Die Fliegen wurden in umgedrehten konischen 50-ml-Röhrchen mit 1 ml fester Nahrung im Deckel gehalten. Um das vergossene Material aufzufangen, wurden die Röhrchen mit 10 ml PBS gespült, 10 s lang gevortext und anschließend wurde ein sauberer Deckel aufgesetzt. Um die Lösung zu konzentrieren, wurden die Proben 7 Minuten lang bei 400 × g in einer Zentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 200 µL PBS resuspendiert. Die konzentrierte Probe wurde auf einem Attune-Durchflusszytometer (Thermo Fisher) gezählt.
Ganze Därme wurden in Cacodylate-Puffer, pH 7,4 (Cac), präpariert und dann 2 Tage lang in 3 % GA + 1 % FA in 0,1 M Cac bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden in Agarose eingebettet und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert. Die Proben wurden dann in Cac-Puffer gewaschen, 1 Stunde lang mit 1 % OsO4 + 1,25 % KfeCN gefärbt, in Wasser gewaschen, mit 0,05 M Maleat, pH 6,5 (Mal), behandelt, 1,25 Stunden lang mit 0,5 % Uranylacetat in Mal gefärbt und dann gewaschen mit steigenden Ethanolkonzentrationen. Zum Einbetten in Harz wurden die Proben mit Harz + Propylenoxid (1:1) behandelt, vor dem Einbetten über Nacht als Übergangslösungsmittel verdampft und dann in Epoxidharz (Epon + Quetol (2:1) + Spurr (3:1) + eingebettet 2 % BDMA über Nacht bei 55 °C und 4 Tage bei 70 °C ausgehärtet.
Die Proben wurden gemäß dem Protokoll in Lit. für XR µCT vorbereitet. 51, das die Autoren vor der Veröffentlichung großzügig zur Verfügung stellten. Kurz gesagt, Fliegen wurden in 1 % Triton-X in PBS gewaschen, um das Kutikulawachs zu reduzieren. Mit einer feinen Wolframnadel wurde ein flaches Loch in den Bauch und den Brustkorb gestochen, um die Durchdringung von Fixiermittel und Farbstoff zu erhöhen. Die Fixierung erfolgte mit Bouin-Lösung. Die Färbung erfolgte 3 Wochen lang mit Phosphorwolframsäure. Die Fliegen wurden zur Bildgebung in einer 10-µL-Mikropipettenspitze mit entionisiertem Wasser montiert und mit Parafilm versiegelt. Die Bildgebung wurde am Synchrotron Advanced Light Source des Lawrence Berkeley National Laboratory an Strahllinie 8.3.2 mit Unterstützung von Dula Parkinson durchgeführt. Pro Probe wurden 1313 Bilder bei 20-facher Vergrößerung und 180 Grad Drehung aufgenommen. Rückprojektionen wurden mit Tomopy mit den folgenden Spezifikationen durchgeführt:
doFWringremoval 0 doPhaseRetrieval 1 alphaReg 0,5 doPolarRing 1 Rmaxwidth 30 Rtmax 300
Weitere Spezifikationen finden Sie hier: http://microct.lbl.gov/. Die Bilder in Abb. 4A, B wurden in Octopus 8.8.2.7 und VG Studio 2.2 erstellt. Volumetrische Rekonstruktionen des Darmlumens in Abb. 4D–G wurden in Imaris mithilfe manueller Segmentierung durchgeführt.
Um Fliegen im OCT (McKessen, 981385) einzubetten, wurden zunächst die Beine und Flügel entfernt. Als nächstes wurden die Fliegen durch Eintauchen und Rühren mit dem OCT-Medium ins Gleichgewicht gebracht, um Blasen zu entfernen. Anschließend wurden die Fliegen in frisches OCT im Cryomold (Ted Pella Inc., 4565, Lot 78652) überführt. Bis zu 5 Fliegen wurden parallel in einer einzigen Form ausgerichtet. Der Block wurde schnell eingefroren, indem er auf ein Bett aus pulverisiertem Trockeneis gelegt und dann bis zum Schneiden bei –80 °C gelagert wurde. 10-µm-Schnitte wurden bei –24 °C mit einem Leica CM3050-Kryostat hergestellt und auf positiv geladene Objektträger (VWR Superfrost Plus, 48311-703) übertragen. Die Schnitte wurden mit einem Mini-Trockenbad (USA Scientific, BSH200) luftgetrocknet und dann bis zur Färbung bei –20 ° C gelagert.
Die Schnitte wurden innerhalb von 2 Tagen nach dem Schneiden fixiert und gefärbt. Zunächst wurde überschüssiges OCT durch kurzes Waschen in HBSS (Cold Harbor Springs Protocol) von den Objektträgern entfernt. Als nächstes wurden die Schnitte 30 Minuten lang in 4 % PFA fixiert und dann einmal in HBSS gewaschen. Vor dem Färben wurden die Schnitte mit 1 % BSA in HBSS blockiert. Die Schnitte wurden 30 Minuten lang mit dem spezifischen Lektin in seiner optimalen Konzentration gefärbt: (12,5 µg/ml Weizenkeim-Agglutinin (WGA – Biotium, 29026-1, Charge 18W1205), 50 µg/ml Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA – Glycomatrix, 21511013- 1, Lot L20092804ZH), 50 µg/ml Lens culinarus Agglutinin (LCA – Glycomatrix, 21511020-1, Lot L20092902ZH) oder 50 µg/ml WGA-Succinylated (S-WGA – Vectorlabs, FL-1021S-5, Lot 2008145) Die Lektinfärbung wurde gleichzeitig mit der Gegenfärbung Calcofluor (Sigma-Aldrich, 910090, Charge MKCL1227) in HBSS durchgeführt. Die Schnitte wurden dann einmal in HBSS und noch einmal in 10 % HBSS gewaschen. Die Schnitte wurden in Eindeckmedium (80 % Glycerin, 20 %) eingehängt % Tris 0,1 M pH 9,0) und mit einem Deckglas Nr. 1 abgedeckt.
Die optimale Konzentration für die Färbung jedes Lektins wurde bestimmt, indem Konzentrationen von 50 µg/ml, 12,5 µg/ml und 3 µg/ml in Gegenwart des spezifischen Haptenzuckers in einer Konzentration von 500 mM hergestellt wurden. Für WGA und S-WGA war der Haptenzucker N-Acetylglucosamin (Vectorlabs, S-9002, Charge ZJ022). Für DBA war der Haptenzucker N-Acetylgalactosamin (Vectorlabs, S-9001, Charge ZJ0301). Für LCA war der Haptenzucker D-Mannose (Sigma, M602025G, Charge SLBG0980V). Die Spezifität jedes Lektins wurde anhand der Hemmung der Färbung durch den Haptenzucker beurteilt. Die niedrigste Lektinkonzentration, die das Gewebe verfärbte und durch den entsprechenden Haptenzucker gehemmt werden konnte, wurde als optimale Konzentration ausgewählt und für nachfolgende Verfahren verwendet.
Statistische Tests wurden in Prism durchgeführt. Im Allgemeinen wurden die Daten mithilfe eines Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität überprüft. Wenn Normalität festgestellt wurde, wurde ein Welch-T-Test durchgeführt. Statistische Tests der CFU-Häufigkeiten wurden an log10-transformierten Daten durchgeführt. Wenn die CFUs 0 waren, wurde das Protokoll auf 0 gesetzt (entsprechend einem Pseudocount von 1). Wenn mehrere Vergleiche durchgeführt wurden, wurde eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA durchgeführt. Wenn sie signifikant waren, wurden mehrere paarweise Vergleiche mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durchgeführt. Wenn die Daten nicht normalverteilt waren, wurden Vergleiche mithilfe von Wilcoxon-Rangordnungstests durchgeführt. Fehlerbalken für Proportionen sind entweder Standardfehler der Proportionen (sep) oder binomiale 95 %-Konfidenzintervalle unter Verwendung der Clopper-Pearson-Methode oder der Jeffries-Methode, wie im Text angegeben. Die statistische Signifikanz der Proportionsunterschiede wurde mithilfe eines Z-Tests bewertet.
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.
Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.
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Das Plasmid pCD256-mCherry64 wurde großzügigerweise von Reingard Grabherr von der BOKU, Österreich, zur Verfügung gestellt. Das Plasmid pCM6266 wurde großzügigerweise von Elizabeth Skovran von der San Jose State University, USA, zur Verfügung gestellt. KCH ist ein Chan-Zuckerberg Biohub-Forscher. Die Finanzierung erfolgte durch Postdoktorandenstipendien des Banting and the Pacific Institute for the Mathematical Sciences an EWJ, ein International Student Research-Stipendium des Howard Hughes Medical Institute, ein Stanford Bio-X Bowes-Stipendium und das Siebel Scholars-Programm an AA-D, das Allen Discovery Center in Stanford über Systems Modeling of Infection an KCH, die David and Lucile Packard Foundation und das Institute for Collaborative Biotechnologies durch Grant W911NF-09-0001 vom US Army Research Office an JMC, einen Discovery Grant des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und das Canada Research Chairs-Programm an DAS, das Howard Hughes Medical Institute an ACS und CW, die National Institutes of Health gewährt DP5OD017851 und R01DK128454 an WBL, die National Science Foundation gewährt IOS 2032985 an WBL und KCH, die National Science Foundation gewährt IOS 2144342 an WBL Carnegie Institution for Science Endowment für WBL und ACS, ein Stipendium der Carnegie Institution of Canada für WBL und DAS und das Ausbildungsstipendium T32GM007231 der National Institutes of Health für KA. Die Arbeiten von ELB und MV wurden durch das Laboratory Directed Research and Development Program des Lawrence Berkeley National Laboratory im Rahmen des Vertrags Nr. DE-AC02-05CH11231 des US-Energieministeriums unterstützt.
Abteilung für Embryologie, Carnegie Institution for Science, Baltimore, MD, 21218, USA
Ren Dodge, Haolong Zhu, Daniel J. Martinez, Chenhui Wang, Kevin Aumiller, Allan C. Spradling und William B. Ludington
Fachbereich Physik, Simon Fraser University, Burnaby, BC, V5A 1S6, Kanada
Eric W. Jones und David A. Sivak
Fachbereich Physik, University of California, Santa Barbara, CA, 93106, USA
Eric W. Jones und Jean M. Carlson
Abteilung für Biologie, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, 21218, USA
Haolong Zhu, Kevin Aumiller, Zhexian Liu, Allan C. Spradling und William B. Ludington
Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA
Benjamin Obadiah
Howard Hughes Medical Institute, Baltimore, MD, 21218, USA
Chenhui Wang & Allan C. Spradling
Abteilung für Bioingenieurwesen, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA
Andrew Aranda-Diaz und Kerwyn Casey Huang
Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA, 94720, USA
Marco Voltolini und Eoin L. Brodie
Institut für Geowissenschaften, Universität Mailand, Mailand, Italien
Marco Voltolini
Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305, USA
Kerwyn Casey Huang
Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, USA
Kerwyn Casey Huang
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RD, EWJ, HZ, BO, CW, EB, JMC, DAS, AS und WBL haben die Forschung entworfen. RD, EWJ, HZ, BO, CW, KA, AA-D., MV und WBL führten die Forschung durch. RD, EWJ, DJM und WBL analysierten die Daten. RD und WBL haben das Manuskript geschrieben. RD, EWJ, KCH, DAS, JMC, ACS und WBL haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das Manuskript vor der Einreichung überprüft.
Korrespondenz mit William B. Ludington.
Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Nature Communications dankt François Leulier und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.
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Dodge, R., Jones, EW, Zhu, H. et al. Eine symbiotische physische Nische in Drosophila melanogaster reguliert die stabile Assoziation einer Multi-Spezies-Darmmikrobiota. Nat Commun 14, 1557 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x
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Eingegangen: 11. Januar 2022
Angenommen: 22. Februar 2023
Veröffentlicht: 21. März 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x
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